【摘 要】
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目的:研究外源性microRNA-101前体的真核表达载体构建方法和其在人胎盘绒毛癌细胞JAR中的表达,及其对靶基因EZH2的沉默作用。方法:利用化学合成法合成microRNA-101前体分子(p
【机 构】
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上海市嘉定区中医医院,同济大学生命科学与技术学院,上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院
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目的:研究外源性microRNA-101前体的真核表达载体构建方法和其在人胎盘绒毛癌细胞JAR中的表达,及其对靶基因EZH2的沉默作用。方法:利用化学合成法合成microRNA-101前体分子(pre-microRNA-101)并克隆至真核表达载体pR-NAT-CMV3.2/Neo。通过酶切及测序法验证该阳性重组质粒pRNAT-CMV3.2-mir101的正确性。体外培养人胎盘绒毛癌细胞JAR;利用脂质体转染法将空白质粒及重组子pRNAT-CMV3.2-mir101转染至JAR细胞。应用Northern blotting检测各组细胞之间成熟microRNA-101(mature microRNA-101)的表达情况;应用Western blotting检测各组细胞中JAR的表达情况。结果:质粒酶切及测序结果显示pRNAT-CMV3.2-mir101上的microRNA-101与合成的pre-microRNA-101寡核苷酸序列完全一致,无碱基的突变和缺失。Northern blotting结果显示,pRNAT-CMV3.2-mir101转染组细胞的总RNA中含有mi-croRNA-101阳性条带,说明该细胞中mature microRNA-101呈高水平表达。Western blotting结果表明,pRNAT-CMV3.2-mir101转染组JAR细胞中的EZH2蛋白表达量(52.76±3.12)%低于对照组(81.18±2.96)%,两者具有显著差异(P<0.05)。结论:通过构建真核细胞表达质粒可以高效表达外源性microRNA分子;microRNA-101可以有效地沉默宿主细胞JAR中靶基因EZH2的表达。
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