采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法。应用建立的方法分别对人、禽、猪以及马流感病毒核酸进行检测,结果显示,建立的方法通用性良好,可有效检测和鉴别H1和H3亚型流感病毒,但对其他亚型的流感病毒以及新城疫病毒核酸检测结果为阴性,表明建立的方法特异性强。进一步经体外转录制备了猪流感病毒H1和H3亚型HA完成编码区的核酸标准品cRNA,经稀释、分装、定量、均匀性和稳定性检验后,作为方法的质控品对建立的方法进行评价,结果表明,所建立的双重短探针实时RT-PCR方法灵敏度可达2.0×102拷贝/反应。在对586份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足动物流感病毒H1/H3亚型的早期快速检测的需求。