为建立同时检测家兔肺炎克雷伯菌(K.pneum oniae)、兔病毒性出血症病毒(RH D V)、多杀性巴氏杆菌(P.m ultocida)和支气管败血波氏杆菌(B.bronchiseptica)的多重PC R方法,根据G en Bank中肺炎克雷伯菌的16S r RN A基因、RHDV的VP60基因、多杀性巴氏杆菌的ktm1基因和支气管败血波氏杆菌的ptx A基因的保守序列设计4对特异性引物,优化反应体系与反应条件,建立能同时扩增兔肺炎克雷伯菌(127bp)、RHDV(322 bp)、多杀性巴氏杆菌(457 bp)和支气管败血波氏杆菌(872 bp)相应基因的四重PCR方法。结果显示,该方法能单管同时特异性检测兔源肺炎克雷伯菌、RHDV、多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏杆菌,且对兔源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌与魏氏梭菌等无特异性扩增,说明该方法具有较强的特异性。该方法的灵敏度分别为9.16、7.24×10-3、7.96、6.8×10-1pg/L。采用建立的方法对人工感染试验病例与临床样本检测结果表明,该方法能快速、特异地鉴别诊断4种病原的单独与混合感染,与单一PCR方法相比,无显著性差异(P>0.05)。该方法的建立为临床上鉴别诊断4种家兔呼吸道疾病病原提供了重要的技术手段。