论文部分内容阅读
摘 要：采用比色法测定青钱柳叶总黄酮（以芦丁计）的含量。对三氯化铝醋酸钾和硝酸铝2种比色法进行比较分析，确定三氯化铝醋酸钾比色法为青钱柳叶总黄酮最佳测定方法，该方法重现性好，精密度和加标回收率高，其RSD分别为1.00%、2.87%和3.06%，4h内显色反应体系稳定性好，标准曲线为Abs =0.2855×C -0.00281，相关系数为0.99926，在0.2～8.0ug/mL范围内符合朗伯比耳定律。本方法适用于青钱柳代用茶中总黄酮的质量分析和质控依据。
关键词：青钱柳叶；总黄酮；三氯化铝醋酸钾比色法；硝酸铝比色法；方法研究
中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180732001
青钱柳Cyclocarya paliurus （ Batal）Iljinsk）为胡桃科青钱柳属植物，别名铜钱树、摇钱树、青钱李、金钱柳等，为我国特有树种，属国家二级保护树种。主要生长于中国南部海拔 420～2500m 的高山地区，是一种药食两用的植物，其根、枝、叶均可入药，可用作传统中药制剂。现代药学研究表明青钱柳具有生津止渴、清热解毒、降三高、抗氧化、提高人体免疫力等功效[1]。陈玮玲等研究表明青钱柳中含有有机酸、酚酸、黄酮、三萜、皂苷类和酯类等，其中酚酸和黄酮类化合物是主要的抗氧化活性成分[2]。青钱柳叶在食品加工领域中作为新食品原料（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013年第10号公告），一般用青钱柳嫩叶作为代用茶原材料，在我国湖南、江西等省份己有部分企业获得青钱柳代用茶食品生产许可证（国家市场监督管理总局网站可查询）。
黄酮类化合物是一类植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，泛指2个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物[3]。黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用等[4]。
食源性植物、药源性植物、保健食品和食品中总黄酮的测定方法主要有直接测定法、薄层色谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法等，高效液相色谱法常用于检测黄酮单体，比色法常用于检测总黄酮量，比色法一般快速、简单、准确，常用比色法（以芦丁计）有直接比色法（360nm）、三氯化铝比色法（312nm）、三氯化铝比色法（416nm）[5] 、三氯化铝醋酸钾比色法（415nm）、硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（510nm）等。经查文献资料，未见关于青钱柳叶中总黄酮三氯化铝醋酸钾比色法（本文简称三氯化铝法）和硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（本文简称硝酸铝法）的比较研究。本文通过光谱扫描、方法评价等验证，比较分析三氯化铝比色法和硝酸铝比色法在青钱柳叶总黄酮（以芦丁计）检测中的应用，建立一套准确、简便、灵敏、重现性好的青钱柳总黄酮检测方法，为青钱柳代用茶及其总黄酮的开发应用提供检测方法、应用基础和质控标准。
1 仪器、试剂等试验材料
1.1 仪器
UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；BSA-224S分析天平、电热恒温水浴锅、KQ5200V型超声波清洗器、常用玻璃器皿等。
1.2 试剂
醋酸钾（AR，含量≥92.0%）；冰醋酸（AR，含量≥99.5%）；三氯化铝（AR，含量≥99.0%）；硝酸铝（AR，含量≥99.0%）；亚硝酸钠（优级纯，含量≥99.0%）；氢氧化钠（优级纯，含量≥98.0%）；无水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.7%）；甲醇（HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.5%）；2.5g/100mL三氯化铝（备注：本试验所用自配试剂均表示为水溶液）；9.82g/100mL醋酸钾； 10g/100mL硝酸铝；5g/100ml亚硝酸钠； 20g/100mL氢氧化钠。
1.3 标准品
以中药对照品芦丁为标准品（CAS号153-18-4，含量98.41%，生产商：北京世紀奥科生物技术有限公司）；标准贮备液Ⅰ：称取0.0100g干燥恒重芦丁用95%乙醇溶解定溶至100mL容量瓶中，配成100ug/mL标准贮备液Ⅰ；标准贮备液Ⅱ：标准贮备液Ⅰ用95%乙醇稀释5倍，配成20ug/mL标准贮备液Ⅱ。
1.4 试验样品
试验样品来源于湘食药科[R201726]课题的科研样品和古丈春风合民族食品开发有限公司（青钱柳代用茶成品）。科研样品为不同季节科研人员现场采摘鲜叶，在试验室进行简单加工：通风阴干（阴干或160～180℃杀青15min后阴干）→60℃恒温复干1h→粉碎过60目筛。
2 实验方法及验证
2.1 基础试剂验证
2.1.1 实验用水验证
用UV-2550仪对检验用纯净水和超纯水进行200～700nm波长扫描，结果发现2种水在扫描波长范围内均无明显吸收峰，且2种试验用水在220～700nm光谱图平直一致。可见试验用纯净水和超纯水对本试验无影响。即本试验用纯净水即可。
2.1.2 实验用有机溶剂验证
通过验证甲醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）和乙醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、95%市售原液、90%AR自配、60%AR自配、30%AR自配）200～700nm波长扫描，结果为乙醇（6种）和甲醇（液相色谱纯原液）在220～700nm均无明显吸收峰，且光谱图平直一致见图1和图2。但甲醇（AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）在260～265nm处有较小的吸收峰见图2。综合考虑试剂对本试验的影响、甲醇有机溶剂的毒性及液相色谱纯试剂成本等因素。故本试验有机溶剂选择AR及自配的不同浓度乙醇较佳。
2.1.3 标准品紫外鉴别[6] 配制4.0ug/mL浓度的芦丁标准溶液（不加显色剂），用UV-2550仪进行200～700nm波长扫描，结果发现芦丁在257±2nm和 358±2nm波长处有最大吸收峰，在358nm波长处测定吸光度，吸收系数为317。证明芦丁标准品符合试验要求。
2.2 显色剂验证
2.2.1 三氯化铝显色剂验证
单一试剂扫描 2.5g/100mL三氯化铝在210～700nm无明显吸收峰；9.82g/100mL醋酸钾250～700nm无明显吸收峰，见图3。
三氯化铝显色剂扫描 取少量95%乙醇于10mL比色管中，加入2.5g/100mL三氯化铝2ml摇均，加入9.82g/100mL醋酸钾2mL，用95%乙醇定容摇均，放置15min后扫描，其在210～700nm波长范围内无明显吸收峰。
标准溶液加三氯化铝显色剂扫描（波长选择）：吸取芦丁标液5.0 mL和10.0mL分别置于2支25mL比色管中，按上法加入三氯化铝和醋酸钾显色剂，用95%乙醇定容摇均，放置15min后扫描。结果为其在265～269nm 波长处有明显吸收峰，在412～415nm有波长最大吸收峰，且吸收峰大小与浓度成一定正比例关系，见图4。综合分析，265nm处的吸收峰离溶剂峰较近，故此法选择最大吸收峰波长415 nm 。
2.2.2 硝酸铝显色剂验证
单一试剂扫描 10g/100mL硝酸铝在200～350nm处有不规则吸收峰； 5g/100mL亚硝酸钠在200～400nm处有不规则吸收峰，20g/100mL氢氧化钠在220～700nm无明显吸收峰；见图5。
硝酸铝显色剂扫描 取少量95%乙醇于10mL比色管中，加入5g/100mL亚硝酸钠1mL混匀放置6min，加入10g/100mL硝酸铝1mL混匀放置6min，加入20g/100mL氢氧化钠4mL，用95%乙醇定容混均放置15min后扫描，其在200～400nm有不规则吸收峰。见图6。
标准溶液加硝酸铝显色剂扫描（波长选择） 吸取上2.2.1同浓度芦丁标液5.0mL和10.0mL分别置于2支25mL比色管中，按上法加入硝酸铝显色剂15min后扫描。结果为其在310～400nm波长处有不规则吸收峰；在510～512nm波长处有明显最大吸收峰，且吸收峰大小与浓度成一定正比例关系，见图4。综合分析，310～400nm波长处吸收峰不规则且不成比例关系，故此法最佳波长为510nm。
2.2.3 2种显色剂法比较
吸取标准贮备液Ⅱ0、1.0、5.0、10.0mL分别置于2套 25mL 比色管中，按2.2.1和2.2.2方法进行显色反应，分别在415 nm和510 nm波长处测吸光度值，所得数据及分析见表1。
通过图4和表1比较可见，相同浓度芦丁标准液用不同的显色剂显色，其在各自最大吸收波长处的吸光度值相差很大，三氯化铝显色法约高2.5倍；从图4可见，硝酸铝显色法在310～400nm波长处有不规则吸收峰（非目标峰），比510～512nm波长处（目标峰）峰值大很多，且相距较近，不规则吸收峰对目标峰的影响因素较大；从表1分析比较，可见三氯化铝显色剂法标曲相关系数为0.999更接近1.00；综合证明三氯化铝显色法对于总黄酮（以芦丁计）检测更灵敏、更准确。故以下试验验证三氯化铝显色法。
2.3 总黄酮三氯化铝显色法的测定方法
2.3.1 样品处理
精确称取约 0.5g 干燥的青钱柳叶粉末样品，置于100mL比色管中，加入 30mL 70%乙醇溶液，浸润混均，在50℃水浴下超声提取0.5h，趁热过滤，收集滤液于100mL容量瓶中，如此重复提取3次，用70%乙醇清洗残渣和滤纸，合并提取液并用70%乙醇定容，摇匀静置（必要时进行4000r/min离心8min处理）4℃保存备用。用移液管精确吸取样液2.0ml于25mL 比色管中，按2.2.1法进行显色反应，于415nm处测定吸光度值。
2.3.2 标准系列
精确吸取標准贮备液Ⅱ20ug/mL芦丁标液0、0.25、0.5、0.75、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0mL 于 25mL 比色管中，按2.2.1方法进行显色反应，并测定吸光度值。芦丁标准系列为0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、 4.0、6.0、8.0ug/mL。
2.3.3 结果计算
根据标准曲线方程，计算出所测样品中总黄酮含量。青钱柳叶总黄酮含量的计算公式：
C（mg/g）=（ρ×25）/（m×v1/v2×1000）
ρ：为样品处理液质量浓度（μg/mL），由吸光度值代入线性方程而得出
25：比色管定容体积（mL）
m： 为青钱柳叶的质量数（g）
v1： 比色取处理液体积（mL）
v2： 处理液定容体积（mL）
1000：单位换算系数
2.4 三氯化铝显色法的方法评价
2.4.1 线性关系考察
三氯化铝显色法用浓度与吸光度值做标曲方程：Abs =0.02855×C -0.00281，相关系数为0.99926，估计的标准误差为0.02394，残余标准偏差为0.02240，多变量相关系数为0.99926，通过标准曲线图谱可见标曲直线均在预标准误差线和95%置信水平线线内（电脑系统查得数据）。同时为验证标曲内线性关系的稳定性及低浓度标曲曲线的线性关系。由不同标准点组成的标准曲线分析见表2。
通过以上分析，本试验以芦丁为标准品用三氯化铝显色法进行线性关系验证，证明吸光度值0.059～2.320范围内和标准浓度0.2～8 ug/mL范围内，其相关系数为0.99926，且标曲1～6相关系数均达0.999，不存在或朗伯比耳定律偏离度较小，证明标准曲线线性关系稳定。 2.4.2 重现性试验
精确称取约 0.5mg青钱柳叶粉末样品（ 5份平行样），按2.3中总黄酮含量的测定方法进行样品检测，检测数据及分析见表3，得出相对标准偏差RSD为1.00%，小于 5.0 %，说明该试验方法重现性好。
2.4.3 稳定性试验
分别精确移取芦丁标准贮备液Ⅰ及样品1-1处理液4.0ml到2支100ml比色管中，用2.2.1三氯化铝显色法进行显色反应（必要时增加显色剂用量），并测定不同显色反应时间吸光度值，见表4。从表4可见吸光度值4h内稳定不变，证明该方法稳定性良好。
2.4.4 精密度试验
用标曲系列中4.0ug/mL芦丁标准显色液，在415 nm处连续测定5次吸光度值，测得吸光度值为1.101、1.100、1.102、1.104、1.103，计算平均吸光度值为1.102，其RSD为2.87%，表明显色反应吸光度值稳定、仪器精密度良好。
2.4.5 加标回收率试验
精确移取己知浓度样品处理滤液0.5mL（ 平行 4 份），分别加入不同量的芦丁标准品（ 20ug/mL，0.5、1.0、1.5、2.0mL），按 2.2.1 方法显色并测定吸光度，见表5，分析得出平均回收率为99.41%，相对标准偏差为 3.06%。表明此方法检测过程目标物损失少、加标回收率高。
3 实验讨论
3.1 通过对基础试剂验证
证明实验室用纯净水和超纯水对本试验无影响，所以本试验选择纯净水即可； 综合考虑实验室用有机溶剂（甲醇和乙醇）对本试验的影响大小、试剂成本及试剂对试验人身体的影响等因素，以选择AR乙醇为宜；证明试验用标准品能满足本试验要求。
3.2 通过对显色试剂及标准溶液显色验证
证明三氯化铝显色剂本身（单一试剂及混合试剂）对本试验无影响；证明标准溶液加三氯化铝显色剂后有明显最大吸收峰，并符合朗伯比耳定律，且相同浓度标准液加2种显色剂其中三氯化铝显色法吸光度值远高于硝酸铝显色法，灵敏性更高。通过对硝酸铝显色剂本身（单一试剂及混合试剂）扫描，其有不规则吸收峰，同时标准品加此显色剂后，在310～400nm波长处有不规则吸收峰（非目标峰），此显色剂对本试验有一定影响。同时硝酸铝顯色法反应并不专一，很多非黄酮类物质也可参与反应并对测定结果产生影响[6]。证明三氯化铝显色法为青钱柳叶总黄酮含量检测最佳选择。
3.3 通过对三氯化铝显色法方法验证
证明标准曲线线性范围0.2～8 ug/mL，标准曲线方程Abs=0.2855×C -0.00281，相关系数0.99926，在线性范围内低浓度和高浓度标准曲线均稳定，相关系数均大于等于0.999；证明三氯化铝显色法试验重现性好、精密度高和加标回收率高，其RSD值分别是1.00%、2.87%和3.06%；证明试验显色方法4h内吸光度值稳定，说明该方法稳定性好。
4 实验结论
通过以上分析，得出结论青钱柳叶总黄酮三氯化铝显色法，0.2～8ug/mL范围内线性关系好，标曲方程Abs =0.2855×C -0.00281，相关系数0.999；重现性RSD为1.00%、精密度RSD为2.87%；加标回收率RSD为3.06%；4h内显色反应稳定性好。此检测方法对青钱柳代用茶产品开发及产品质量检测有实际指导意义。
参考文献
[1]苏玉卿，李佳桐.青钱柳研究进展[J].农技服务，2016（1）：（33）：5-7.
[2]陈玮玲.钟培培.王远兴.青钱柳叶活性成分的 UPLC-QTOF-MS 分析及抗氧化活性[J].食品科学，2016（11）：11-12.
[3]吴立军.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社，2003：173-184.
[4]张培成.黄酮化学[M].北京：化学工业出版社，2008：1-4， 227-243.
[5]俞燕，厉飞.山核桃叶中总黄酮含量测定[J].中华中医药学刊.2012，30（7）：1622-1625.
[6]周春华，孙崇德.富含绿原酸的植物中类黄酮测定方法探讨[J].植物生理学通讯，2007，43（5）：902-904.
作者简介：张学英（1975-），女，湖南古丈人，高级工程师，研究方向：食品质量安全检测及食品安全监管。
关键词：青钱柳叶；总黄酮；三氯化铝醋酸钾比色法；硝酸铝比色法；方法研究
中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180732001
青钱柳Cyclocarya paliurus （ Batal）Iljinsk）为胡桃科青钱柳属植物，别名铜钱树、摇钱树、青钱李、金钱柳等，为我国特有树种，属国家二级保护树种。主要生长于中国南部海拔 420～2500m 的高山地区，是一种药食两用的植物，其根、枝、叶均可入药，可用作传统中药制剂。现代药学研究表明青钱柳具有生津止渴、清热解毒、降三高、抗氧化、提高人体免疫力等功效[1]。陈玮玲等研究表明青钱柳中含有有机酸、酚酸、黄酮、三萜、皂苷类和酯类等，其中酚酸和黄酮类化合物是主要的抗氧化活性成分[2]。青钱柳叶在食品加工领域中作为新食品原料（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013年第10号公告），一般用青钱柳嫩叶作为代用茶原材料，在我国湖南、江西等省份己有部分企业获得青钱柳代用茶食品生产许可证（国家市场监督管理总局网站可查询）。
黄酮类化合物是一类植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，泛指2个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物[3]。黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用等[4]。
食源性植物、药源性植物、保健食品和食品中总黄酮的测定方法主要有直接测定法、薄层色谱法、 高效液相色谱法、毛细管电泳法、紫外分光光度法等，高效液相色谱法常用于检测黄酮单体，比色法常用于检测总黄酮量，比色法一般快速、简单、准确，常用比色法（以芦丁计）有直接比色法（360nm）、三氯化铝比色法（312nm）、三氯化铝比色法（416nm）[5] 、三氯化铝醋酸钾比色法（415nm）、硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（510nm）等。经查文献资料，未见关于青钱柳叶中总黄酮三氯化铝醋酸钾比色法（本文简称三氯化铝法）和硝酸铝亚硝酸钠氢氧化钠比色法（本文简称硝酸铝法）的比较研究。本文通过光谱扫描、方法评价等验证，比较分析三氯化铝比色法和硝酸铝比色法在青钱柳叶总黄酮（以芦丁计）检测中的应用，建立一套准确、简便、灵敏、重现性好的青钱柳总黄酮检测方法，为青钱柳代用茶及其总黄酮的开发应用提供检测方法、应用基础和质控标准。
1 仪器、试剂等试验材料
1.1 仪器
UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；BSA-224S分析天平、电热恒温水浴锅、KQ5200V型超声波清洗器、常用玻璃器皿等。
1.2 试剂
醋酸钾（AR，含量≥92.0%）；冰醋酸（AR，含量≥99.5%）；三氯化铝（AR，含量≥99.0%）；硝酸铝（AR，含量≥99.0%）；亚硝酸钠（优级纯，含量≥99.0%）；氢氧化钠（优级纯，含量≥98.0%）；无水乙醇（UV-HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.7%）；甲醇（HPLC，含量≥99.9%；AR，含量≥99.5%）；2.5g/100mL三氯化铝（备注：本试验所用自配试剂均表示为水溶液）；9.82g/100mL醋酸钾； 10g/100mL硝酸铝；5g/100ml亚硝酸钠； 20g/100mL氢氧化钠。
1.3 标准品
以中药对照品芦丁为标准品（CAS号153-18-4，含量98.41%，生产商：北京世紀奥科生物技术有限公司）；标准贮备液Ⅰ：称取0.0100g干燥恒重芦丁用95%乙醇溶解定溶至100mL容量瓶中，配成100ug/mL标准贮备液Ⅰ；标准贮备液Ⅱ：标准贮备液Ⅰ用95%乙醇稀释5倍，配成20ug/mL标准贮备液Ⅱ。
1.4 试验样品
试验样品来源于湘食药科[R201726]课题的科研样品和古丈春风合民族食品开发有限公司（青钱柳代用茶成品）。科研样品为不同季节科研人员现场采摘鲜叶，在试验室进行简单加工：通风阴干（阴干或160～180℃杀青15min后阴干）→60℃恒温复干1h→粉碎过60目筛。
2 实验方法及验证
2.1 基础试剂验证
2.1.1 实验用水验证
用UV-2550仪对检验用纯净水和超纯水进行200～700nm波长扫描，结果发现2种水在扫描波长范围内均无明显吸收峰，且2种试验用水在220～700nm光谱图平直一致。可见试验用纯净水和超纯水对本试验无影响。即本试验用纯净水即可。
2.1.2 实验用有机溶剂验证
通过验证甲醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）和乙醇（液相色谱纯原液、AR市售原液、95%市售原液、90%AR自配、60%AR自配、30%AR自配）200～700nm波长扫描，结果为乙醇（6种）和甲醇（液相色谱纯原液）在220～700nm均无明显吸收峰，且光谱图平直一致见图1和图2。但甲醇（AR市售原液、90%AR自配、70%AR自配）在260～265nm处有较小的吸收峰见图2。综合考虑试剂对本试验的影响、甲醇有机溶剂的毒性及液相色谱纯试剂成本等因素。故本试验有机溶剂选择AR及自配的不同浓度乙醇较佳。
2.1.3 标准品紫外鉴别[6] 配制4.0ug/mL浓度的芦丁标准溶液（不加显色剂），用UV-2550仪进行200～700nm波长扫描，结果发现芦丁在257±2nm和 358±2nm波长处有最大吸收峰，在358nm波长处测定吸光度，吸收系数为317。证明芦丁标准品符合试验要求。
2.2 显色剂验证
2.2.1 三氯化铝显色剂验证
单一试剂扫描 2.5g/100mL三氯化铝在210～700nm无明显吸收峰；9.82g/100mL醋酸钾250～700nm无明显吸收峰，见图3。
三氯化铝显色剂扫描 取少量95%乙醇于10mL比色管中，加入2.5g/100mL三氯化铝2ml摇均，加入9.82g/100mL醋酸钾2mL，用95%乙醇定容摇均，放置15min后扫描，其在210～700nm波长范围内无明显吸收峰。
标准溶液加三氯化铝显色剂扫描（波长选择）：吸取芦丁标液5.0 mL和10.0mL分别置于2支25mL比色管中，按上法加入三氯化铝和醋酸钾显色剂，用95%乙醇定容摇均，放置15min后扫描。结果为其在265～269nm 波长处有明显吸收峰，在412～415nm有波长最大吸收峰，且吸收峰大小与浓度成一定正比例关系，见图4。综合分析，265nm处的吸收峰离溶剂峰较近，故此法选择最大吸收峰波长415 nm 。
2.2.2 硝酸铝显色剂验证
单一试剂扫描 10g/100mL硝酸铝在200～350nm处有不规则吸收峰； 5g/100mL亚硝酸钠在200～400nm处有不规则吸收峰，20g/100mL氢氧化钠在220～700nm无明显吸收峰；见图5。
硝酸铝显色剂扫描 取少量95%乙醇于10mL比色管中，加入5g/100mL亚硝酸钠1mL混匀放置6min，加入10g/100mL硝酸铝1mL混匀放置6min，加入20g/100mL氢氧化钠4mL，用95%乙醇定容混均放置15min后扫描，其在200～400nm有不规则吸收峰。见图6。
标准溶液加硝酸铝显色剂扫描（波长选择） 吸取上2.2.1同浓度芦丁标液5.0mL和10.0mL分别置于2支25mL比色管中，按上法加入硝酸铝显色剂15min后扫描。结果为其在310～400nm波长处有不规则吸收峰；在510～512nm波长处有明显最大吸收峰，且吸收峰大小与浓度成一定正比例关系，见图4。综合分析，310～400nm波长处吸收峰不规则且不成比例关系，故此法最佳波长为510nm。
2.2.3 2种显色剂法比较
吸取标准贮备液Ⅱ0、1.0、5.0、10.0mL分别置于2套 25mL 比色管中，按2.2.1和2.2.2方法进行显色反应，分别在415 nm和510 nm波长处测吸光度值，所得数据及分析见表1。
通过图4和表1比较可见，相同浓度芦丁标准液用不同的显色剂显色，其在各自最大吸收波长处的吸光度值相差很大，三氯化铝显色法约高2.5倍；从图4可见，硝酸铝显色法在310～400nm波长处有不规则吸收峰（非目标峰），比510～512nm波长处（目标峰）峰值大很多，且相距较近，不规则吸收峰对目标峰的影响因素较大；从表1分析比较，可见三氯化铝显色剂法标曲相关系数为0.999更接近1.00；综合证明三氯化铝显色法对于总黄酮（以芦丁计）检测更灵敏、更准确。故以下试验验证三氯化铝显色法。
2.3 总黄酮三氯化铝显色法的测定方法
2.3.1 样品处理
精确称取约 0.5g 干燥的青钱柳叶粉末样品，置于100mL比色管中，加入 30mL 70%乙醇溶液，浸润混均，在50℃水浴下超声提取0.5h，趁热过滤，收集滤液于100mL容量瓶中，如此重复提取3次，用70%乙醇清洗残渣和滤纸，合并提取液并用70%乙醇定容，摇匀静置（必要时进行4000r/min离心8min处理）4℃保存备用。用移液管精确吸取样液2.0ml于25mL 比色管中，按2.2.1法进行显色反应，于415nm处测定吸光度值。
2.3.2 标准系列
精确吸取標准贮备液Ⅱ20ug/mL芦丁标液0、0.25、0.5、0.75、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0mL 于 25mL 比色管中，按2.2.1方法进行显色反应，并测定吸光度值。芦丁标准系列为0、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、 4.0、6.0、8.0ug/mL。
2.3.3 结果计算
根据标准曲线方程，计算出所测样品中总黄酮含量。青钱柳叶总黄酮含量的计算公式：
C（mg/g）=（ρ×25）/（m×v1/v2×1000）
ρ：为样品处理液质量浓度（μg/mL），由吸光度值代入线性方程而得出
25：比色管定容体积（mL）
m： 为青钱柳叶的质量数（g）
v1： 比色取处理液体积（mL）
v2： 处理液定容体积（mL）
1000：单位换算系数
2.4 三氯化铝显色法的方法评价
2.4.1 线性关系考察
三氯化铝显色法用浓度与吸光度值做标曲方程：Abs =0.02855×C -0.00281，相关系数为0.99926，估计的标准误差为0.02394，残余标准偏差为0.02240，多变量相关系数为0.99926，通过标准曲线图谱可见标曲直线均在预标准误差线和95%置信水平线线内（电脑系统查得数据）。同时为验证标曲内线性关系的稳定性及低浓度标曲曲线的线性关系。由不同标准点组成的标准曲线分析见表2。
通过以上分析，本试验以芦丁为标准品用三氯化铝显色法进行线性关系验证，证明吸光度值0.059～2.320范围内和标准浓度0.2～8 ug/mL范围内，其相关系数为0.99926，且标曲1～6相关系数均达0.999，不存在或朗伯比耳定律偏离度较小，证明标准曲线线性关系稳定。 2.4.2 重现性试验
精确称取约 0.5mg青钱柳叶粉末样品（ 5份平行样），按2.3中总黄酮含量的测定方法进行样品检测，检测数据及分析见表3，得出相对标准偏差RSD为1.00%，小于 5.0 %，说明该试验方法重现性好。
2.4.3 稳定性试验
分别精确移取芦丁标准贮备液Ⅰ及样品1-1处理液4.0ml到2支100ml比色管中，用2.2.1三氯化铝显色法进行显色反应（必要时增加显色剂用量），并测定不同显色反应时间吸光度值，见表4。从表4可见吸光度值4h内稳定不变，证明该方法稳定性良好。
2.4.4 精密度试验
用标曲系列中4.0ug/mL芦丁标准显色液，在415 nm处连续测定5次吸光度值，测得吸光度值为1.101、1.100、1.102、1.104、1.103，计算平均吸光度值为1.102，其RSD为2.87%，表明显色反应吸光度值稳定、仪器精密度良好。
2.4.5 加标回收率试验
精确移取己知浓度样品处理滤液0.5mL（ 平行 4 份），分别加入不同量的芦丁标准品（ 20ug/mL，0.5、1.0、1.5、2.0mL），按 2.2.1 方法显色并测定吸光度，见表5，分析得出平均回收率为99.41%，相对标准偏差为 3.06%。表明此方法检测过程目标物损失少、加标回收率高。
3 实验讨论
3.1 通过对基础试剂验证
证明实验室用纯净水和超纯水对本试验无影响，所以本试验选择纯净水即可； 综合考虑实验室用有机溶剂（甲醇和乙醇）对本试验的影响大小、试剂成本及试剂对试验人身体的影响等因素，以选择AR乙醇为宜；证明试验用标准品能满足本试验要求。
3.2 通过对显色试剂及标准溶液显色验证
证明三氯化铝显色剂本身（单一试剂及混合试剂）对本试验无影响；证明标准溶液加三氯化铝显色剂后有明显最大吸收峰，并符合朗伯比耳定律，且相同浓度标准液加2种显色剂其中三氯化铝显色法吸光度值远高于硝酸铝显色法，灵敏性更高。通过对硝酸铝显色剂本身（单一试剂及混合试剂）扫描，其有不规则吸收峰，同时标准品加此显色剂后，在310～400nm波长处有不规则吸收峰（非目标峰），此显色剂对本试验有一定影响。同时硝酸铝顯色法反应并不专一，很多非黄酮类物质也可参与反应并对测定结果产生影响[6]。证明三氯化铝显色法为青钱柳叶总黄酮含量检测最佳选择。
3.3 通过对三氯化铝显色法方法验证
证明标准曲线线性范围0.2～8 ug/mL，标准曲线方程Abs=0.2855×C -0.00281，相关系数0.99926，在线性范围内低浓度和高浓度标准曲线均稳定，相关系数均大于等于0.999；证明三氯化铝显色法试验重现性好、精密度高和加标回收率高，其RSD值分别是1.00%、2.87%和3.06%；证明试验显色方法4h内吸光度值稳定，说明该方法稳定性好。
4 实验结论
通过以上分析，得出结论青钱柳叶总黄酮三氯化铝显色法，0.2～8ug/mL范围内线性关系好，标曲方程Abs =0.2855×C -0.00281，相关系数0.999；重现性RSD为1.00%、精密度RSD为2.87%；加标回收率RSD为3.06%；4h内显色反应稳定性好。此检测方法对青钱柳代用茶产品开发及产品质量检测有实际指导意义。
参考文献
[1]苏玉卿，李佳桐.青钱柳研究进展[J].农技服务，2016（1）：（33）：5-7.
[2]陈玮玲.钟培培.王远兴.青钱柳叶活性成分的 UPLC-QTOF-MS 分析及抗氧化活性[J].食品科学，2016（11）：11-12.
[3]吴立军.天然药物化学[M].北京：人民卫生出版社，2003：173-184.
[4]张培成.黄酮化学[M].北京：化学工业出版社，2008：1-4， 227-243.
[5]俞燕，厉飞.山核桃叶中总黄酮含量测定[J].中华中医药学刊.2012，30（7）：1622-1625.
[6]周春华，孙崇德.富含绿原酸的植物中类黄酮测定方法探讨[J].植物生理学通讯，2007，43（5）：902-904.
作者简介：张学英（1975-），女，湖南古丈人，高级工程师，研究方向：食品质量安全检测及食品安全监管。