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摘要：漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，常被称为对苯二酚的氧化酶。本文讨论白腐菌产漆酶的过程，漆酶对靛蓝和金橙Ⅱ在脱色氧化降解方面的研究，从实验的数据我们得到：漆酶在氧化降解靛蓝时最适合的pH=4.5，最佳温度是30℃，用 3.9 IU/mL的漆酶来进行脱色降解反应时，420 min时脱色较完全，可以达90%；而漆酶氧化降解脱色金橙Ⅱ的适合的条件是pH=4.0，30℃，采用浓度为13.5 IU/mL 的漆酶处理含有金橙Ⅱ的溶液，反应达500min时，脱色较完全，可以达到90%以上。
关键词：白腐菌；漆酶；靛蓝；金橙Ⅱ； 脱色降解
引言
漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，利用氧把对苯二酚（也叫氢醌）氧化后能生成对苯醌，也常被称为对苯二酚的氧化酶，一般存在于真菌和植物中[1][2]。
由于近代染料工业的快速发展，使得染料工业对环境的污染成为当前的重大课题[3]，而漆酶能在染料的降解方面具有独特的效果，当前成为环境处理的重点产业之一。
一、真菌漆酶的微生物生产
（一）菌种、试剂仪器及培养基
白腐菌（white rot fung NS8），南昌大学生命科学学院保藏。
2，2?-连氮-双（3-乙基并噻-6-磺酸）（ABTS）、2，5-二甲代苯胺（XYL），Sigma公司；其它试剂都为分析纯。
高压灭菌锅；摇床；冷冻离心机；UV-1800型紫外分光光度计。
（二）CPDA培养基
综合培养基（又称cpda培养基）： 马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B110毫克，琼脂18-20克，自来水1000毫升，pH5-6。
（三）菌种的筛选
本文中白腐菌是从枯枝上采集而来，然后再进行白腐真菌的逐步筛选。在实际方案中，为了提高筛选的效率，菌种筛选方案常常将筛选分为初筛和复筛两步完成[4] 。
1.产漆酶的初筛
将采集来的枯枝，取其中的白色块状物，用无菌水来按不同浓度（102、103、104）进行稀释，而且平行做三次。然后采用平板涂布分离法，将不同梯度的菌样分别接种到CPDA固体培养基上，在30℃培养箱中培养，每天观察菌种的生长情况。通过平板涂布法筛选出单个优良的菌落，用接种环进行反复的转接，最后将所分离的菌株用CPDA试管斜面于5℃冰箱中保存。
2.产漆酶菌的复筛
将初筛得到的菌株平板种用打孔器取两个直径5mm的菌塞 ，接种到装50mL产酶培养基的锥形瓶中，在30℃、150r/min振荡培养50h，测定发酵液的粗酶活力。
（四）分离纯化
先用快速定性滤纸过滤最优发酵条件下的发酵液，获得粗酶液，然后利用盐析对粗酶液进行处理；再用凝胶过滤进一步分离提纯。
二、漆酶降解染料的研究
白腐菌中的酶是一些较为特殊的酶，人们常常用来它来降解木质素以及其他难降解的一些物质。特别是那些具有较高毒性、而不同结构的、高分子难以降解的有机化合类物质，如染料等[5]。
（一）漆酶对靛蓝的脱色研究
1.pH值对靛蓝脱色的影响
配制pH值分别为3.0～6.0的靛蓝系列溶液，分别把等量酶液加入后混合均匀并且定容至50mL，完成脱色降解实验。得到的数据如图2-1中所示：脱色效果较好时pH值在4.0～5.0之间，脱色率可以到75%以上。且pH=4.5时，脱色率最高能达82%。而pH≦4.0或pH≧6.0时，脱色的效果要差一些，因此我们认为漆酶在脱色降解靛蓝反应时的最佳pH值=4.5。
2.温度对漆酶降解靛蓝的影响
温度在漆酶对靛蓝脱色的影响如图2-2。从图中可以得到，在实验过程中，随着温度逐渐升高，脱色的速度也逐渐加快，达到脱色平衡时间明显缩短，但是在平衡的时候脱色率也会有降低。例如在50°C时，反应经过100min，脱色率可以达到80%以上；但在30-40°C时，反应需要240 min后才能使脱色率达到90%。我们选择35°C作为漆酶降解靛蓝的脱色温度。
（二）漆酶对金橙Ⅱ的脱色研究
1.pH对漆酶降解金橙Ⅱ的影响
配制pH值从3.0～6.0的金橙Ⅱ染料溶液，进行染料的脱色降解实验，结果以下图2-3所示，脱色效果最好的时候溶液pH值为4.0～5.0范围，脱色率可以达到93%以上。在pH=4.0时，脱色率为95.5%达到最高。
2. 漆酶量对降解金橙Ⅱ的影响
在30°C，调整金橙Ⅱ溶液的pH值为4.0，使用不同浓度的漆酶溶液对金橙Ⅱ溶液进行降解脱色的实验，结果见图2-4所示。我们可以从实验数据得到，脱色率开始会与作用时间保持一致的变化关系，但反应达到300min以后，变化逐渐平缓；而且当酶液的量加大时，脱色率也会跟着增大。14.0 IU/mL的酶量是较为合适的，作用540min，脱色率可达到90%。如果进一步增加漆酶的用量，脱色率并没有很明显的提高。所以降解金橙Ⅱ的最佳漆酶用量为14.0 IU/mL。
三、小结
本文的工作主要是研究白腐菌漆酶的液体发酵及其对染料靛蓝和金橙Ⅱ的降解脱色效果。通过实验研究和数据分析得出以下结论：
（一）漆酶降解靛蓝适宜pH值为4.5，适宜温度为30°C。在3.75 IU/mL漆酶的作用下，420min脱色率可达到82%。
（二）漆酶降解脱色金橙Ⅱ的适宜条件为pH4.0， 30℃，采用14.0IU/mL的漆酶处理金橙Ⅱ溶液，作用540min，脱色率可达到90%。
参考文献
[1] 季立才，胡培植.漆酶的结构、功能及其应用[J].氨基酸和生物资源，1996，18 （1）：25～29.
[2] 许颖，兰进.真菌漆酶研究进展[J].食用菌学报，2005，2 （l）：57～64.
[3] 缪静，姜竹茂.漆酶的最新研究进展[J].烟台师范学院学报（自然科学版）.2001，17（2）：146～150.
[4] 张敏，肖亚中，蒲春雷.白腐真菌AH28-2菌株发酵合成漆酶初步研究[J].微生物学通报，2002，17（3）：37～42
关键词：白腐菌；漆酶；靛蓝；金橙Ⅱ； 脱色降解
引言
漆酶（E.C.1.10.3.2）是一类含铜的氧化还原酶，利用氧把对苯二酚（也叫氢醌）氧化后能生成对苯醌，也常被称为对苯二酚的氧化酶，一般存在于真菌和植物中[1][2]。
由于近代染料工业的快速发展，使得染料工业对环境的污染成为当前的重大课题[3]，而漆酶能在染料的降解方面具有独特的效果，当前成为环境处理的重点产业之一。
一、真菌漆酶的微生物生产
（一）菌种、试剂仪器及培养基
白腐菌（white rot fung NS8），南昌大学生命科学学院保藏。
2，2?-连氮-双（3-乙基并噻-6-磺酸）（ABTS）、2，5-二甲代苯胺（XYL），Sigma公司；其它试剂都为分析纯。
高压灭菌锅；摇床；冷冻离心机；UV-1800型紫外分光光度计。
（二）CPDA培养基
综合培养基（又称cpda培养基）： 马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B110毫克，琼脂18-20克，自来水1000毫升，pH5-6。
（三）菌种的筛选
本文中白腐菌是从枯枝上采集而来，然后再进行白腐真菌的逐步筛选。在实际方案中，为了提高筛选的效率，菌种筛选方案常常将筛选分为初筛和复筛两步完成[4] 。
1.产漆酶的初筛
将采集来的枯枝，取其中的白色块状物，用无菌水来按不同浓度（102、103、104）进行稀释，而且平行做三次。然后采用平板涂布分离法，将不同梯度的菌样分别接种到CPDA固体培养基上，在30℃培养箱中培养，每天观察菌种的生长情况。通过平板涂布法筛选出单个优良的菌落，用接种环进行反复的转接，最后将所分离的菌株用CPDA试管斜面于5℃冰箱中保存。
2.产漆酶菌的复筛
将初筛得到的菌株平板种用打孔器取两个直径5mm的菌塞 ，接种到装50mL产酶培养基的锥形瓶中，在30℃、150r/min振荡培养50h，测定发酵液的粗酶活力。
（四）分离纯化
先用快速定性滤纸过滤最优发酵条件下的发酵液，获得粗酶液，然后利用盐析对粗酶液进行处理；再用凝胶过滤进一步分离提纯。
二、漆酶降解染料的研究
白腐菌中的酶是一些较为特殊的酶，人们常常用来它来降解木质素以及其他难降解的一些物质。特别是那些具有较高毒性、而不同结构的、高分子难以降解的有机化合类物质，如染料等[5]。
（一）漆酶对靛蓝的脱色研究
1.pH值对靛蓝脱色的影响
配制pH值分别为3.0～6.0的靛蓝系列溶液，分别把等量酶液加入后混合均匀并且定容至50mL，完成脱色降解实验。得到的数据如图2-1中所示：脱色效果较好时pH值在4.0～5.0之间，脱色率可以到75%以上。且pH=4.5时，脱色率最高能达82%。而pH≦4.0或pH≧6.0时，脱色的效果要差一些，因此我们认为漆酶在脱色降解靛蓝反应时的最佳pH值=4.5。
2.温度对漆酶降解靛蓝的影响
温度在漆酶对靛蓝脱色的影响如图2-2。从图中可以得到，在实验过程中，随着温度逐渐升高，脱色的速度也逐渐加快，达到脱色平衡时间明显缩短，但是在平衡的时候脱色率也会有降低。例如在50°C时，反应经过100min，脱色率可以达到80%以上；但在30-40°C时，反应需要240 min后才能使脱色率达到90%。我们选择35°C作为漆酶降解靛蓝的脱色温度。
（二）漆酶对金橙Ⅱ的脱色研究
1.pH对漆酶降解金橙Ⅱ的影响
配制pH值从3.0～6.0的金橙Ⅱ染料溶液，进行染料的脱色降解实验，结果以下图2-3所示，脱色效果最好的时候溶液pH值为4.0～5.0范围，脱色率可以达到93%以上。在pH=4.0时，脱色率为95.5%达到最高。
2. 漆酶量对降解金橙Ⅱ的影响
在30°C，调整金橙Ⅱ溶液的pH值为4.0，使用不同浓度的漆酶溶液对金橙Ⅱ溶液进行降解脱色的实验，结果见图2-4所示。我们可以从实验数据得到，脱色率开始会与作用时间保持一致的变化关系，但反应达到300min以后，变化逐渐平缓；而且当酶液的量加大时，脱色率也会跟着增大。14.0 IU/mL的酶量是较为合适的，作用540min，脱色率可达到90%。如果进一步增加漆酶的用量，脱色率并没有很明显的提高。所以降解金橙Ⅱ的最佳漆酶用量为14.0 IU/mL。
三、小结
本文的工作主要是研究白腐菌漆酶的液体发酵及其对染料靛蓝和金橙Ⅱ的降解脱色效果。通过实验研究和数据分析得出以下结论：
（一）漆酶降解靛蓝适宜pH值为4.5，适宜温度为30°C。在3.75 IU/mL漆酶的作用下，420min脱色率可达到82%。
（二）漆酶降解脱色金橙Ⅱ的适宜条件为pH4.0， 30℃，采用14.0IU/mL的漆酶处理金橙Ⅱ溶液，作用540min，脱色率可达到90%。
参考文献
[1] 季立才，胡培植.漆酶的结构、功能及其应用[J].氨基酸和生物资源，1996，18 （1）：25～29.
[2] 许颖，兰进.真菌漆酶研究进展[J].食用菌学报，2005，2 （l）：57～64.
[3] 缪静，姜竹茂.漆酶的最新研究进展[J].烟台师范学院学报（自然科学版）.2001，17（2）：146～150.
[4] 张敏，肖亚中，蒲春雷.白腐真菌AH28-2菌株发酵合成漆酶初步研究[J].微生物学通报，2002，17（3）：37～42