探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制。
方法取1～3 d龄SD大鼠乳鼠，分离培养心肌细胞，用于以下实验。(1)取细胞，按随机数字表法(分组方法下同)分为TRAP1组和对照组，提取细胞总蛋白。TRAP1组细胞总蛋白加入小鼠抗大鼠TRAP1单克隆一抗，对照组细胞总蛋白加入小鼠来源的同型IgG，免疫共沉淀法和蛋白质谱分析检测TRAP1可能作用的蛋白。(2)取细胞，分为常氧空白对照组、常氧＋TRAP1干扰对照组、常氧＋TRAP1干扰组、常氧＋TRAP1过表达对照组、常氧＋TRAP1过表达组，每组1孔。常氧空白对照组细胞常规培养，后4组细胞分别加入TRAP1 RNA干扰空病毒载体、TRAP1 RNA干扰腺病毒载体、TRAP1过表达空病毒载体、TRAP1过表达腺病毒载体。另取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组，每组1孔。各缺氧组细胞同前对应的常氧组细胞处理后，缺氧6 h。实时荧光定量RT－PCR检测各组细胞中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COXⅡ)mRNA表达。本实验重复3次。(3)取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组，每组3孔。前4组细胞的处理同(2)，后2组细胞分别加入COXⅡ RNA干扰空病毒载体、COXⅡ RNA干扰腺病毒载体转染后，再分别加入TRAP1过表达腺病毒载体。细胞计数试剂盒8及酶标仪检测细胞增殖活性，碘化丙啶和Hoechst 33342染色检测细胞死亡率。另取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达对照组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达组，每组3孔，前4组细胞的处理同(2)，后2组细胞均加入TRAP1 RNA干扰腺病毒载体转染后，再分别加入COXⅡ过表达空病毒载体、COXⅡ过表达腺病毒载体，同前检测细胞增殖活性和死亡率。本实验重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD检验。
结果(1)TRAP1组细胞有TRAP1表达，对照组细胞未见TRAP1表达。TRAP1可能作用的3个蛋白是角蛋白、COX Ⅱ和预测分子量为13×103的未知蛋白。(2)与常氧空白对照组比较，常氧＋TRAP1干扰对照组、常氧＋TRAP1过表达对照组细胞COXⅡ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05)，常氧＋TRAP1干扰组细胞COXⅡ mRNA表达量明显降低(P<0.01)，常氧＋TRAP1过表达组细胞COXⅡ mRNA表达量明显升高(P<0.01)。缺氧空白对照组细胞COXⅡ mRNA表达量较常氧空白对照组明显降低(P<0.01)。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组细胞COXⅡ mRNA表达量无明显变化(P值均大于0.05)，缺氧＋TRAP1干扰组细胞COXⅡ mRNA表达量明显下降(P<0.01)，缺氧＋TRAP1过表达组细胞COXⅡ mRNA表达量明显升高(P<0.01)。(3)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组细胞增殖活性分别为0.498±0.022、0.303±0.018、0.313±0.032、0.456±0.031、0.448±0.034、0.335±0.026，细胞死亡率分别为(4.7±1.5)%、(24.7±3.1)%、(26.0±2.7)%、(13.3±2.5)%、(12.7±2.1)%、(21.0±1.7)%。与常氧空白对照组比较，缺氧空白对照组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01)。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05)，缺氧＋TRAP1过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.01)。与缺氧＋TRAP1过表达组比较，缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05)，缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01)。(4)常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达对照组、缺氧＋TRAP1干扰＋COX Ⅱ过表达组细胞增殖活性分别为0.444±0.025、0.275±0.016、0.283±0.021、0.150±0.009、0.135±0.011、0.237±0.017，细胞死亡率分别为(3.7±0.6)%、(21.0±2.7)%、(20.3±3.1)%、(31.7±2.5)%、(33.3±3.2)%、(19.3±1.5)%。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05)。与缺氧空白对照组和缺氧＋TRAP1干扰对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加(P值均小于0.01)。与缺氧＋TRAP1干扰组比较，缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化(P值均大于0.05)，缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低(P值均小于0.01)。
结论TRAP1能够正向调节COXⅡ mRNA表达， COXⅡ是TRAP1保护缺氧心肌细胞的下游效应分子。