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[摘 要]本文主要介绍了几种常用转基因种子的检测方法，主要包括定性PCR检测方法、实时荧光定量PCR检测方法、特异蛋白检测法和生物表现型检测法，并简要介绍了这些方法的应用和优缺点，可供转基因种子检测研究参考。
[关键词]墓因；品种；种子；特异性；检测；蛋白质
中图分类号：S329 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）23-0080-01
随着全球和我国植物转基因品种的推广应用，转基因种子的应用越来越广泛。作为高科技产品，价格自然比较高，经營利润也水涨船高。个别种子经销商为追求高利润以假充真，以次充好，严重损害农民的利益，给农民和消费者带来无法估量的损失。因此，为维护市场环境，保护消费者利益，选择合适的检测方法对植物转基因品种进行真实性和纯度鉴定是十分必要的。目前，我国能开展检测的转基因产品主要有大豆、玉米、油菜、水稻、棉花等作物及其制品。本文将较全面地概述常用转基因种子的检测方法，并分析其各自的特点。
1 定性PCR检测技术
以PCR技术为基础的转基因种子定性检测，根据其特异性的不同至少可以分为4类：筛查法、基因特异性方法、构建特异性方法和转化事件特异性方法。
1.1 筛查法
对转基因种子中的通用元件进行检测，包括启动子、终止子和报告基因NPT-II等。最常见的是对CaMV35S启动子或NOS终止子的检测。仅仅鉴定筛选基因，已经不能满足转基因产品检测的要求。这是因为35S启动子存在于天然花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类的报告基因自然界中也普遍存在，因而仅是检测筛选基因，极易出现假阳性结果，同时也达不到鉴定转基因植物的目的。
1.2 基因特异性方法
是指插人DNA序列或特定因子（在整合位置的DNA序列）对目的基因进行检测。检测时，能获取的目的基因的数量要比启动子和终止子多很多。因此，以目的基因为特征序列的基因特异法更具有特异性。
1.3 构建特异性方法
是指通过检测外源插人载体中两个元件的连接区的DNA序列，在转化载体中具有完整表达能力的目的基因的基因盒上设计引物，来确定基因的构建方式的检测方法。这种方法具有相对较高的特异性，但是由于相同的转基因外源表达载体在转化过程中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性地区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。
1.4 转化事件特异性方法
是指通过检测外源插人载体与植物基因组的连接区序列，通过扩增受体基因组和插人DNA的连接区域，鉴定含有相同外源DNA的不同GMO。由于每一个转基因植物品系都具有特异的外源插人载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，因此受体基因组和插人DNA的连接区域对于被检测的GMO有很好的特异性。
2 实时荧光定量PCR检测方法
该方法是对转基因种子进行定量标志的主要方法。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测PCR产物的积累，可以非常精确地定量转基因含量。与常规PCR相比，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前，实时荧光定量PCR均采用外标定量，即以已知浓度的目的基因为模板，按一定的比例稀释，做出标准曲线图，然后只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
3 特异蛋白质检测方法
3.1 酶联免疫检侧方法
该方法是一种免疫化学测定技术，依赖的是抗原（导人基因在受体作物中得到正确表达产生的蛋白质）和抗体能发生特异性结合的原理。该法可定性和定量测定种子样品所提取的转基因蛋白质。先把转基因蛋白质的抗体吸附在ELISA微孔板上作为固相，再将从种子样品提取的蛋白质溶液加到微孔板，温育使抗体与靶蛋白联合。然后将微孔板进行洗涤，再将用于测定抗体与转基因蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加人微孔板，第二抗体与酶偶联的作用可形成一温育使抗体与靶蛋白联合。然后将微孔板进行洗涤，再将用于测定抗体与转基因蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加入微孔板。第二抗体与酶偶联的作用可形成一种检测信号的标记。利用已知浓度蛋白质标准和阴性对照与样品比较就可实现定量测定。查对预先制备的靶蛋白浓度标准曲线，就可估测转基因蛋白质数量。
该方法具有很多优点：特异性强。灵敏度高，样品易于保存，结果易于观察，可以定量测定，仪器和试剂简单，比PCR方法节省成本，且比PCR和生物表现型检测方法快。目前，该方法已经被广泛地用于分析测定转基因作物中外源基因表达的靶蛋白质的水平。然而，该方法也有一定的局限性：（1）有些外源基因不能导致特异性重组蛋白质的表达或表达的水平太低而无法检测；（2）特异性蛋白质有时仅在作物的特定部位或在一定的生理阶段合成，有时在不同部位其表达水平也不一致；（3）由于转人的目的基因的种类众多，抗体种类需求也多；（4）不能区别转入同一目的蛋白的两种不同的转基因植物。因此，酶联免疫检测方法不能作为转基因检测时的首选方法。
3.2 横向侧流条浏定
是一种快速稳定的定性测定，检查转基因种子蛋白质是否存在。其方法是利用试剂盒的带有抗体的纸条或塑料浆片直接浸一下样品提取液。如果样品提取液中存在转基因蛋白质，试纸上抗体与转基因蛋白质之间就会发生反应，引起横向流式纸条颜色的变化，而确定转基因蛋白质的存在。
4 生物表现型检测方法
生物表现型检测需做发芽试验，培育幼苗，观察幼苗是否具有转基因的特定性状（如抗虫或耐除草剂等），而非转基因幼苗在除草剂处理的培养基上则受伤害或死亡，从而区分出耐除草剂的转基因幼苗。该方法是将种子播种在经特定除草剂处理的固体发芽床上发芽，观察幼苗伤害情况。因此，测定的正确性取决于种子发芽率。但重要的是选用适合的发芽方法，以确保全部有生活力种子均能发芽。高发芽率可增加测定的置信水平。并且测定计划中应设置阴性和阳性性状种子，以作为对照。检测水平和定量精度取决于测定种子数量。
生物表现型检测方法的优点是可利用现有种子实验室的设备和经验，而且成本低，并且利用特定性状鉴定转基因种子非常正确，不仅可测定转基因的基因产物，而且可判定其生物活性。其缺点是只能测定活的发芽种子，还需要每个性状分开测定，并且每个测定至少需7天，不能直接从种子测得结果，只能测定幼苗的结果。特别测定抗虫性状就更麻烦，需较长的生长期间，以产生较为有效的叶片喂虫。
[关键词]墓因；品种；种子；特异性；检测；蛋白质
中图分类号：S329 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2013）23-0080-01
随着全球和我国植物转基因品种的推广应用，转基因种子的应用越来越广泛。作为高科技产品，价格自然比较高，经營利润也水涨船高。个别种子经销商为追求高利润以假充真，以次充好，严重损害农民的利益，给农民和消费者带来无法估量的损失。因此，为维护市场环境，保护消费者利益，选择合适的检测方法对植物转基因品种进行真实性和纯度鉴定是十分必要的。目前，我国能开展检测的转基因产品主要有大豆、玉米、油菜、水稻、棉花等作物及其制品。本文将较全面地概述常用转基因种子的检测方法，并分析其各自的特点。
1 定性PCR检测技术
以PCR技术为基础的转基因种子定性检测，根据其特异性的不同至少可以分为4类：筛查法、基因特异性方法、构建特异性方法和转化事件特异性方法。
1.1 筛查法
对转基因种子中的通用元件进行检测，包括启动子、终止子和报告基因NPT-II等。最常见的是对CaMV35S启动子或NOS终止子的检测。仅仅鉴定筛选基因，已经不能满足转基因产品检测的要求。这是因为35S启动子存在于天然花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类的报告基因自然界中也普遍存在，因而仅是检测筛选基因，极易出现假阳性结果，同时也达不到鉴定转基因植物的目的。
1.2 基因特异性方法
是指插人DNA序列或特定因子（在整合位置的DNA序列）对目的基因进行检测。检测时，能获取的目的基因的数量要比启动子和终止子多很多。因此，以目的基因为特征序列的基因特异法更具有特异性。
1.3 构建特异性方法
是指通过检测外源插人载体中两个元件的连接区的DNA序列，在转化载体中具有完整表达能力的目的基因的基因盒上设计引物，来确定基因的构建方式的检测方法。这种方法具有相对较高的特异性，但是由于相同的转基因外源表达载体在转化过程中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性地区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。
1.4 转化事件特异性方法
是指通过检测外源插人载体与植物基因组的连接区序列，通过扩增受体基因组和插人DNA的连接区域，鉴定含有相同外源DNA的不同GMO。由于每一个转基因植物品系都具有特异的外源插人载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，因此受体基因组和插人DNA的连接区域对于被检测的GMO有很好的特异性。
2 实时荧光定量PCR检测方法
该方法是对转基因种子进行定量标志的主要方法。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测PCR产物的积累，可以非常精确地定量转基因含量。与常规PCR相比，该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。目前，实时荧光定量PCR均采用外标定量，即以已知浓度的目的基因为模板，按一定的比例稀释，做出标准曲线图，然后只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
3 特异蛋白质检测方法
3.1 酶联免疫检侧方法
该方法是一种免疫化学测定技术，依赖的是抗原（导人基因在受体作物中得到正确表达产生的蛋白质）和抗体能发生特异性结合的原理。该法可定性和定量测定种子样品所提取的转基因蛋白质。先把转基因蛋白质的抗体吸附在ELISA微孔板上作为固相，再将从种子样品提取的蛋白质溶液加到微孔板，温育使抗体与靶蛋白联合。然后将微孔板进行洗涤，再将用于测定抗体与转基因蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加人微孔板，第二抗体与酶偶联的作用可形成一温育使抗体与靶蛋白联合。然后将微孔板进行洗涤，再将用于测定抗体与转基因蛋白质之间反应的第2个蛋白质抗体加入微孔板。第二抗体与酶偶联的作用可形成一种检测信号的标记。利用已知浓度蛋白质标准和阴性对照与样品比较就可实现定量测定。查对预先制备的靶蛋白浓度标准曲线，就可估测转基因蛋白质数量。
该方法具有很多优点：特异性强。灵敏度高，样品易于保存，结果易于观察，可以定量测定，仪器和试剂简单，比PCR方法节省成本，且比PCR和生物表现型检测方法快。目前，该方法已经被广泛地用于分析测定转基因作物中外源基因表达的靶蛋白质的水平。然而，该方法也有一定的局限性：（1）有些外源基因不能导致特异性重组蛋白质的表达或表达的水平太低而无法检测；（2）特异性蛋白质有时仅在作物的特定部位或在一定的生理阶段合成，有时在不同部位其表达水平也不一致；（3）由于转人的目的基因的种类众多，抗体种类需求也多；（4）不能区别转入同一目的蛋白的两种不同的转基因植物。因此，酶联免疫检测方法不能作为转基因检测时的首选方法。
3.2 横向侧流条浏定
是一种快速稳定的定性测定，检查转基因种子蛋白质是否存在。其方法是利用试剂盒的带有抗体的纸条或塑料浆片直接浸一下样品提取液。如果样品提取液中存在转基因蛋白质，试纸上抗体与转基因蛋白质之间就会发生反应，引起横向流式纸条颜色的变化，而确定转基因蛋白质的存在。
4 生物表现型检测方法
生物表现型检测需做发芽试验，培育幼苗，观察幼苗是否具有转基因的特定性状（如抗虫或耐除草剂等），而非转基因幼苗在除草剂处理的培养基上则受伤害或死亡，从而区分出耐除草剂的转基因幼苗。该方法是将种子播种在经特定除草剂处理的固体发芽床上发芽，观察幼苗伤害情况。因此，测定的正确性取决于种子发芽率。但重要的是选用适合的发芽方法，以确保全部有生活力种子均能发芽。高发芽率可增加测定的置信水平。并且测定计划中应设置阴性和阳性性状种子，以作为对照。检测水平和定量精度取决于测定种子数量。
生物表现型检测方法的优点是可利用现有种子实验室的设备和经验，而且成本低，并且利用特定性状鉴定转基因种子非常正确，不仅可测定转基因的基因产物，而且可判定其生物活性。其缺点是只能测定活的发芽种子，还需要每个性状分开测定，并且每个测定至少需7天，不能直接从种子测得结果，只能测定幼苗的结果。特别测定抗虫性状就更麻烦，需较长的生长期间，以产生较为有效的叶片喂虫。