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【摘要】 目的 观察脂易消对非酒精性脂肪肝SD大鼠CYP2E1 mRNA的调控效果。方法 将60只大鼠随机分为正常组、模型组、易善复对照组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组。正常组给予标准饲料喂养；低、中、高剂量治疗组均给予高脂饲料喂养，同时分别灌服低、中、高剂量脂易消；易善复对照组给予高脂饲料喂养，灌服易复善。结果 从肝组织CYP2E1相对表达量（V值）来看，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组（P<0.01），而各剂量组大鼠与易善复组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达。
【关键词】 脂易消； 非酒精性脂肪肝； CYP2E1基因表达
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.02.090
目前认为，脂肪肝的发生与脂肪细胞因子相关性损害有关。脂肪组织是一个新的内分泌器官，对全身各器官系统及脂肪组织本身有重要调节功能。它们通过诱导脂肪细胞的凋亡及脂肪细胞的分化，调控脂肪组织的量[1]。目前，对非酒精性脂肪肝（NAFL）发病机理的研究已深入到基因水平，有学者研究表明，非酒精性脂肪肝细胞色素P450 1A1（CYP1A1）基因及表达变化[2]、肝细胞色素P450 2E1（CYP2E1）基因及表达变化、肝细胞色素P450 2E1（CYP2E1）基因中c2基因及表达变化[3]与非酒精性脂肪肝发生发展的关系密切。
脂易消为长期临床实践中总结出来的临床效验方，主要由枳壳、半夏、泽泻、决明子、荷叶、鼠麹草等组成，有祛湿解毒、消痰散瘀、降脂抑脂之功效。长期临床观察和前期课题证实其疗效确切[4]，为临床治疗脂肪肝的有效方药。笔者现将脂易消对非酒精性脂肪肝CYP2E1基因表达的调控研究情况报告如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物 将60只大鼠随机分成6组，每组10只。（1）正常对照组。给予标准饲料喂养，灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。（2）模型对照组。给予高脂饲料喂养,灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。（3）低剂量治疗组。给予高脂饲料喂养，灌服低剂量脂易消［相当于生药6 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（4）中剂量治疗组。简称中剂量组，给予高脂饲料喂养,灌服中剂量脂易消［相当于生药12 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（5）高剂量治疗组。给予高脂饲料喂养,灌服高剂量脂易消［相当于生药24 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（6）易善复对照组给予高脂饲料喂养，灌服易善复水溶液12 ml/kg［相当于6.92 mg/（kg•d）］，1次/d，共12周。第12周周末晚禁食16 h后，次日上午将实验大鼠以3%戊巴比妥钠按0.15 ml/kg腹腔内注射麻醉后，先腹主动脉取血约4 ml，之后剪开胸腔，取出肝脏，迅速在4 ℃生理盐水中冲洗后，于电子秤上秤重，然后在肝右叶中部切取数块肝组织液氮速冻后保存于-80 ℃以提取总RNA，用于检测肝细胞中CYP2E1 mRNA的表达。
1.2 技术方法 RT-PCR检测CYP2E1 mRNA表达。（1）总RNA提取。从-70 ℃冰箱中取出300 mg肝组织，用液氮将组织研磨成粉末，并加入Trizo 12 ml研磨，转移研磨好的液体到无RNA酶和无DNA酶的1.5 ml离心管中。然后加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡混匀30 s后，室温离心12 000 r/min×5 min；吸取上层水相溶液并转移至另一新鲜的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止5 min，再次室温离心12 000 r/min×5 min，弃上清，然后加入70％乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用0.05 ml DEPC去离子水重新溶解RNA。提取的总RNA经紫外线分光光度计测定提取物的浓度，A260／A280比值在1.8～2.0之间。（2）合成相关引物。根据核苷酸序列用Primer premier 5.0设计引物，提交上海生物工程有限公司进行合成，CYP2E1 mRNA引物序列如下：CYP2E1上游引物：5′-AGG GAG ACG CAG GTGT-3′；下游引物：5′-CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA-3′，扩增片段368 bp。内参照β-actin上游引物：5′-ATG CCA TCC TGC GTC TG-3′；下游引物：5′-ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT-3′，扩增片段578 bp。（3）逆转录反应。用上述细胞中提取的总RNA在下述反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下：5×Buffer 5 μl、oligd（dT）10 pmol、dNTP（2.5 mM）4 μl、RNA酶抑制剂1 μl、M-MLV逆转录酶5 U。以DEPC水补齐至25 μl，轻轻混匀，室温放置10 min后移入42 ℃恒温槽中。42 ℃保温1 h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2 min。所得到的反应液即可用于PCR反应中作为逆转录反应液。（4）PCR反应。取上述逆转录反应产物于50 μl反应体积中进行PCR反应。反应体积组成如下：10×Reaction Buffer 5 μl、4种dNTP的混合物（每种2.5 mM）2 μl、TaqDNA多聚酶（3 μ/μl）、逆转录反应液3 μl、上下游特异引物各1 μl、去离子水35 μl。先在94 ℃预变性5 min，然后按下述条件循环30次，变性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸5 min。（5）PCR产物分析。PCR产物5 μl经1%琼脂糖（含溴化乙锭溶液0.5 μg/ml）凝胶电泳2 h，另取3 μl Marker作为DNA片段大小的对照。凝胶电泳后，应用天能图像分析系统进行扫描，用BandScan分析，测定产物条带的吸光度值，以β-actin为基准，做半定量分析，即CYP2E1 mRNA的相对表达水平以CYP2E1/β-actin值表示。
2 结果
采用反转录PCR（RT-PCR）法检测肝组织CYP2E1 mRNA相对表达量。从肝组织CYP2E1相对表达量（V值）来看，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组（P<0.01），而各剂量组大鼠与易善复组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 结论
脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达细胞色素P450，是一组相对非特异性酶，广泛存在于机体内，但主要存在于肝细胞内质网上（微粒体），负责外来物及某些体内代谢物质的生物转化，此酶可被某些化合物（包括药物）诱导或抑制，影响化合物在体内的代谢速度。在人的肝微粒体中，参与内源性物质和外源性物质（包括药物和环境污染物）代谢的细胞色素P450主要有CYP lA2、2E1和3A，其中CYP 2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。人和大鼠的CYP 2E1是由单基因调控，并且所有CYP 2E1的底物在人和动物中都是相同的。本课题结果显示，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组（P<0.01），而各剂量组大鼠与易善复组无明显差异（P>0.05），表明脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达。脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达，可能是其防治非酒精性脂肪肝的重要作用机理之一。
参 考 文 献
［1］ 繆正秋.脂肪肝的防治［J］.宁波高等专科学校学报,1999,11(4):116.
［2］ 范建高,曾民德.脂肪肝的研究进展［J］.胃肠病学和肝病学杂志,1999,8(2):149-151.
［3］ Guan Y, Breyer MD. Targeting Peroxisome Proliferators-activated recePtors(PPARs) in kidney and urologic disease［J］. Minerva Urol Nefrol,2002,54:65-79.
［4］ 卢书伟,蔡皓东,崔振宇.脂肪肝的药物治疗［J］.中国新药杂志,2001,10(12):76.
（收稿日期：2011-11-16）
（本文编辑：连胜利）
【关键词】 脂易消； 非酒精性脂肪肝； CYP2E1基因表达
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.02.090
目前认为，脂肪肝的发生与脂肪细胞因子相关性损害有关。脂肪组织是一个新的内分泌器官，对全身各器官系统及脂肪组织本身有重要调节功能。它们通过诱导脂肪细胞的凋亡及脂肪细胞的分化，调控脂肪组织的量[1]。目前，对非酒精性脂肪肝（NAFL）发病机理的研究已深入到基因水平，有学者研究表明，非酒精性脂肪肝细胞色素P450 1A1（CYP1A1）基因及表达变化[2]、肝细胞色素P450 2E1（CYP2E1）基因及表达变化、肝细胞色素P450 2E1（CYP2E1）基因中c2基因及表达变化[3]与非酒精性脂肪肝发生发展的关系密切。
脂易消为长期临床实践中总结出来的临床效验方，主要由枳壳、半夏、泽泻、决明子、荷叶、鼠麹草等组成，有祛湿解毒、消痰散瘀、降脂抑脂之功效。长期临床观察和前期课题证实其疗效确切[4]，为临床治疗脂肪肝的有效方药。笔者现将脂易消对非酒精性脂肪肝CYP2E1基因表达的调控研究情况报告如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物 将60只大鼠随机分成6组，每组10只。（1）正常对照组。给予标准饲料喂养，灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。（2）模型对照组。给予高脂饲料喂养,灌服生理盐水12 ml/kg，1次/d，共12周。（3）低剂量治疗组。给予高脂饲料喂养，灌服低剂量脂易消［相当于生药6 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（4）中剂量治疗组。简称中剂量组，给予高脂饲料喂养,灌服中剂量脂易消［相当于生药12 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（5）高剂量治疗组。给予高脂饲料喂养,灌服高剂量脂易消［相当于生药24 g/（kg•d）］水溶液12 ml/kg，1次/d，共12周。（6）易善复对照组给予高脂饲料喂养，灌服易善复水溶液12 ml/kg［相当于6.92 mg/（kg•d）］，1次/d，共12周。第12周周末晚禁食16 h后，次日上午将实验大鼠以3%戊巴比妥钠按0.15 ml/kg腹腔内注射麻醉后，先腹主动脉取血约4 ml，之后剪开胸腔，取出肝脏，迅速在4 ℃生理盐水中冲洗后，于电子秤上秤重，然后在肝右叶中部切取数块肝组织液氮速冻后保存于-80 ℃以提取总RNA，用于检测肝细胞中CYP2E1 mRNA的表达。
1.2 技术方法 RT-PCR检测CYP2E1 mRNA表达。（1）总RNA提取。从-70 ℃冰箱中取出300 mg肝组织，用液氮将组织研磨成粉末，并加入Trizo 12 ml研磨，转移研磨好的液体到无RNA酶和无DNA酶的1.5 ml离心管中。然后加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡混匀30 s后，室温离心12 000 r/min×5 min；吸取上层水相溶液并转移至另一新鲜的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止5 min，再次室温离心12 000 r/min×5 min，弃上清，然后加入70％乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用0.05 ml DEPC去离子水重新溶解RNA。提取的总RNA经紫外线分光光度计测定提取物的浓度，A260／A280比值在1.8～2.0之间。（2）合成相关引物。根据核苷酸序列用Primer premier 5.0设计引物，提交上海生物工程有限公司进行合成，CYP2E1 mRNA引物序列如下：CYP2E1上游引物：5′-AGG GAG ACG CAG GTGT-3′；下游引物：5′-CTG ATA CTG GTC GTA GGT GA-3′，扩增片段368 bp。内参照β-actin上游引物：5′-ATG CCA TCC TGC GTC TG-3′；下游引物：5′-ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACAT-3′，扩增片段578 bp。（3）逆转录反应。用上述细胞中提取的总RNA在下述反应体系中逆转录成cDNA，该反应体系组成如下：5×Buffer 5 μl、oligd（dT）10 pmol、dNTP（2.5 mM）4 μl、RNA酶抑制剂1 μl、M-MLV逆转录酶5 U。以DEPC水补齐至25 μl，轻轻混匀，室温放置10 min后移入42 ℃恒温槽中。42 ℃保温1 h进行逆转录反应。反应结束后在冰水中冷却2 min。所得到的反应液即可用于PCR反应中作为逆转录反应液。（4）PCR反应。取上述逆转录反应产物于50 μl反应体积中进行PCR反应。反应体积组成如下：10×Reaction Buffer 5 μl、4种dNTP的混合物（每种2.5 mM）2 μl、TaqDNA多聚酶（3 μ/μl）、逆转录反应液3 μl、上下游特异引物各1 μl、去离子水35 μl。先在94 ℃预变性5 min，然后按下述条件循环30次，变性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸5 min。（5）PCR产物分析。PCR产物5 μl经1%琼脂糖（含溴化乙锭溶液0.5 μg/ml）凝胶电泳2 h，另取3 μl Marker作为DNA片段大小的对照。凝胶电泳后，应用天能图像分析系统进行扫描，用BandScan分析，测定产物条带的吸光度值，以β-actin为基准，做半定量分析，即CYP2E1 mRNA的相对表达水平以CYP2E1/β-actin值表示。
2 结果
采用反转录PCR（RT-PCR）法检测肝组织CYP2E1 mRNA相对表达量。从肝组织CYP2E1相对表达量（V值）来看，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组（P<0.01），而各剂量组大鼠与易善复组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3 结论
脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达细胞色素P450，是一组相对非特异性酶，广泛存在于机体内，但主要存在于肝细胞内质网上（微粒体），负责外来物及某些体内代谢物质的生物转化，此酶可被某些化合物（包括药物）诱导或抑制，影响化合物在体内的代谢速度。在人的肝微粒体中，参与内源性物质和外源性物质（包括药物和环境污染物）代谢的细胞色素P450主要有CYP lA2、2E1和3A，其中CYP 2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化许多前致癌物和前毒物的活化过程。人和大鼠的CYP 2E1是由单基因调控，并且所有CYP 2E1的底物在人和动物中都是相同的。本课题结果显示，模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达水平较正常组明显增高（P<0.01）；脂易消各剂量组和易善复组显著低于模型组（P<0.01），而各剂量组大鼠与易善复组无明显差异（P>0.05），表明脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达。脂易消能明显降低NAFL大鼠肝脏中CYP2E1 mRNA的表达，可能是其防治非酒精性脂肪肝的重要作用机理之一。
参 考 文 献
［1］ 繆正秋.脂肪肝的防治［J］.宁波高等专科学校学报,1999,11(4):116.
［2］ 范建高,曾民德.脂肪肝的研究进展［J］.胃肠病学和肝病学杂志,1999,8(2):149-151.
［3］ Guan Y, Breyer MD. Targeting Peroxisome Proliferators-activated recePtors(PPARs) in kidney and urologic disease［J］. Minerva Urol Nefrol,2002,54:65-79.
［4］ 卢书伟,蔡皓东,崔振宇.脂肪肝的药物治疗［J］.中国新药杂志,2001,10(12):76.
（收稿日期：2011-11-16）
（本文编辑：连胜利）