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摘要[目的]建立小蓟愈伤组织的诱导及增殖培养体系。[方法]以野生小蓟无菌苗叶片为外植体，分析2，4D、6BA、NAA对小蓟愈伤组织的诱导及增殖的影响，确定最适宜的激素组合。[结果]单因素条件下，0.8 mg/L 2，4D、0.9 mg/L 6BA、2.0 mg/L NAA为小蓟叶片愈伤组织诱导的最佳浓度；MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L培养基为小蓟叶片愈伤组织最适诱导组合。单因素条件下，2，4D、NAA不适合小蓟愈伤组织增殖培养，MS+6BA 0.3 mg/L为小蓟叶片愈伤最佳增殖培养基。[结论]该研究为小蓟的进一步开发利用奠定基础。
关键词小蓟；叶片；愈伤组织诱导；愈伤组织增殖；优化
中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-067-03
Abstract[Objective] The research aimed to establish the systems of callus induction and proliferation of Cirsium setosum.[Method]With leaves aseptic Cirsium setosum seedlings as explants， the effect of 2，4D，6BA and NAA on callus induction and proliferation of Cirsium setosum were researched. The optimum combination of hormones was determined.[Result]Under ingle factor design， the callus induction were better inducted in MS medium with 0.8 mg/L 2，4D，0.9 mg/L 6BA and 2.0 mg/L NAA. The optimum medium for the callus induction was MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L. The optimum medium for the callus proliferation was MS+6BA 0.3 mg/L. 2，4D and NAA were not suitable for callus proliferation.[Conclusion] The study provides a foundation for further development and utilization of Cirsium setosum.
Key wordsCirsium setosum；Leaf；Callus induction；Callus proliferation；Optimization
小薊（Cirsium setosum），又称刺儿菜、萋萋菜、刺角芽等，为菊科蓟属多年生草本植物[1]，是一种常用的本草中药材，有很好的止血、凝血和抗炎功效[2-3]，其提取物对肿瘤细胞活性有抑制作用，同时小蓟还是一种营养丰富的蔬菜[4]。但小蓟多以野生状态为主，其有效成分的形成机制、利用以及开发受到了限制。建立一套稳定的小蓟组织培养体系，是小蓟深入研究的基础。该试验以小蓟无菌苗叶片为供试材料，确立小蓟最佳的愈伤组织诱导及增殖条件，为小蓟的进一步开发利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
野生小蓟种子采自华北理工大学校园。
1.2方法
1.2.1无菌苗培养。
小蓟种子用1.0%升汞溶液浸泡10～20 min，无菌水冲洗3～4次，再用75%酒精浸泡10～20 s，无菌水冲洗4～5次，然后接种于MS培养基（10 g/L蔗糖、4 g/L琼脂、pH 5.0～6.0）[5-6]。
1.2.2培养条件。
无菌苗培养、愈伤组织诱导及增殖均在光照培养箱中。采用光周期12 h/d、光强6 000 lx、温度25 ℃的培养条件。选择MS+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂（pH 6.0）作为愈伤诱导及增殖的基本培养基。
1.2.3植物调节剂对小蓟叶片愈伤组织诱导。
单因素条件下，确定2，4D（0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.4、0.7、0.9、1.1、1.5 mg/L ）、NAA（0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L）对小蓟愈伤组织诱导影响；采用L9（34）正交设计，设置2，4D（0.6、0.8、1.0 mg/L）、6BA（0.7、0.9、1.1 mg/L）和NAA（1.5、2.0、2.5 mg/L）三因素三水平试验[7]，筛选最适宜的诱导培养条件。
选择长势良好的无菌苗叶片，剪成约5 mm×5 mm大小接种于不同的诱导培养基上，观察愈伤组织的生长状态，培养21 d后，统计愈伤组织重量诱导系数（愈伤组织重量/外植体接种重量）和诱导率。
1.2.4小蓟叶片愈伤组织增殖。
单因素条件下，确定2，4D（0、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.1、0.3、0.5、0.8 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）对小蓟愈伤组织增殖的影响及适宜条件。选择生长旺盛、有光泽的小蓟愈伤组织，剪成约6 mm×6 mm×6 mm大小接种于不同的愈伤组织增殖培养基上。培养21 d后，计算愈伤增殖率，观察愈伤组织状态，确定小蓟愈伤组织增殖适宜的激素浓度范围。
2结果与分析 2.1单因素条件下植物生长调节剂对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响
单因素结果显示（表1），2，4D对小蓟叶片愈伤组织诱导率最高，最早6 d即可诱导出愈伤组织；在0.4～2.0 mg/L范围内，诱导率为100%，愈伤组织呈白绿色，细胞透明度均较低；在0.8 mg/L条件下，21 d愈伤组织重量诱导系数最高，达46.91，愈伤组织生长状态最优。
6BA对愈伤组织诱导率一般，愈伤组织出现时间早于对照3～4 d；在0.4～1.5 mg/L范围内，均能诱导得到愈伤组织，质量较差，褐化严重；在0.9 mg/L条件下，21 d愈伤组织重量诱导系数最高，达15.09。
NAA对愈伤组织诱导率较好，愈伤组织出现时间早于对照4～5 d；在1.0～3.0 mg/L条件范围内，均能诱导得到愈伤组织，有褐化现象；在2.0 mg/L条件下，愈伤组织重量诱导系数最高，达26.65，愈伤组织出现的时间较短，生长状态较好。
2.2正交试验优化小蓟叶片愈伤组织诱导
正交试验结果显示，9种培养基对小蓟叶片愈伤组织均有较高诱导率，均达100%，愈伤组织呈白绿色或黄绿色，细胞透明度均较低（表2和图1）。
极差分析结果显示，NAA不同浓度重量诱导系数的极差最大，NAA对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响最大，3种植物生长调剂对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响主次顺序为NAA>6BA >2，4D。从诱导系数平均值分析可知，最佳愈伤诱导培养基组合为MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L。验证得到，该培养基中能获得最优诱导效果，愈伤组织呈白绿色，质地松软，愈伤组织重量诱导系数为113.06，为所有激素处理最高（图2）。
2.33种激素对小蓟叶片愈伤组织增殖的影响
单因素试验显示（表3），6BA对小蓟愈伤组织增殖效果较好，愈伤组织团较大，呈淡绿或绿色，细胞透明度均低，在0.3 mg/L条件下，愈伤组织增殖率最高；2，4D和NAA对小蓟愈伤组织增殖效果较差，愈伤组织团较小，诱导率低，呈白色或淡青色，较为松软，不适合小蓟愈伤组织的增殖培养。因此，确定MS+6BA 0.3 mg/L为小蓟愈伤组织增殖的最佳培养基。
3结论与讨论
MS培养基无机盐浓度较高，适合植物组织培养[8]。试验中选择MS培养基为基本培养基。植物调节剂是植物愈伤组织培养的关键因素。2，4D、6BA、NAA植物调节剂在一定范围内均能促进植物愈伤组织培养[7，9-10]。
2，4D、6BA、NAA 3种激素对小蓟愈伤组织诱导及增殖
均有不同程度的影响。单因素试验条件下，3种激素均能成
功诱导出小蓟叶片愈伤组织，最佳浓度分别是2，4D 0.8 mg/L、6BA 0.9 mg/L、NAA 2.0 mg/L，其中2，4D的诱导效果最佳，NAA对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响最大。3种激素配合使用，在MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L培养基中，诱导效果最好。在2，4D 和NAA单因素条件下，小蓟愈伤组织增殖率极低，有褐化现象，不适于增殖培養；6BA对小蓟愈伤组织增殖率相对较高，MS+6BA 0.3 mg/L培养基为愈伤组织增殖的最适条件。
参考文献
[1] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第一分册[M].北京：科学出版社，1991：569.
[2] 孟永海.小蓟的化学成分研究[D].佳木斯：黑龙江中医药大学，2007：4-5.
[3] 祁爱蓉，徐彩，蔡芬芳.小蓟、小蓟炭的主要成份及止血作用研究综述[J].内蒙古中医药，2012（20）：96-99.
[4] 李桂凤，万春燕，岳辉.野生蔬菜：刺儿菜营养价值与食疗方[J].东方食疗与保健，2004（10）：70.
[5] 王宏霞.波棱瓜种子萌发特性和组织培养研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008：25-26.
[6] 姜长阳.培养基琼脂用量的商榷[J].植物生理学通讯，1990，16（2）：53-54.
[7] 李代丽，康向阳.植物愈伤组织培养中内外源激素效应的研究现状与展望[J].生物技术通讯，2007，18（3）：546-548.
[8] 潘佑找，赵金萍，曾祥秒，等.野生乳头百合组织培养及快速繁殖研究[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8256-8258.
[9] 王允威，刁毅.NAA与BA对康乃馨愈伤组织诱导的影响[J].广东化工，2012，39（10）：19-21.
[10] 李文静，李学强，贾毛毛，等.6BA、NAA和2，4D不同配比对荠菜愈伤组织诱导、生长及植株再生的影响[J].植物生理学报，2012，48（2）：141-146.
关键词小蓟；叶片；愈伤组织诱导；愈伤组织增殖；优化
中图分类号S567.23+9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）26-067-03
Abstract[Objective] The research aimed to establish the systems of callus induction and proliferation of Cirsium setosum.[Method]With leaves aseptic Cirsium setosum seedlings as explants， the effect of 2，4D，6BA and NAA on callus induction and proliferation of Cirsium setosum were researched. The optimum combination of hormones was determined.[Result]Under ingle factor design， the callus induction were better inducted in MS medium with 0.8 mg/L 2，4D，0.9 mg/L 6BA and 2.0 mg/L NAA. The optimum medium for the callus induction was MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L. The optimum medium for the callus proliferation was MS+6BA 0.3 mg/L. 2，4D and NAA were not suitable for callus proliferation.[Conclusion] The study provides a foundation for further development and utilization of Cirsium setosum.
Key wordsCirsium setosum；Leaf；Callus induction；Callus proliferation；Optimization
小薊（Cirsium setosum），又称刺儿菜、萋萋菜、刺角芽等，为菊科蓟属多年生草本植物[1]，是一种常用的本草中药材，有很好的止血、凝血和抗炎功效[2-3]，其提取物对肿瘤细胞活性有抑制作用，同时小蓟还是一种营养丰富的蔬菜[4]。但小蓟多以野生状态为主，其有效成分的形成机制、利用以及开发受到了限制。建立一套稳定的小蓟组织培养体系，是小蓟深入研究的基础。该试验以小蓟无菌苗叶片为供试材料，确立小蓟最佳的愈伤组织诱导及增殖条件，为小蓟的进一步开发利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
野生小蓟种子采自华北理工大学校园。
1.2方法
1.2.1无菌苗培养。
小蓟种子用1.0%升汞溶液浸泡10～20 min，无菌水冲洗3～4次，再用75%酒精浸泡10～20 s，无菌水冲洗4～5次，然后接种于MS培养基（10 g/L蔗糖、4 g/L琼脂、pH 5.0～6.0）[5-6]。
1.2.2培养条件。
无菌苗培养、愈伤组织诱导及增殖均在光照培养箱中。采用光周期12 h/d、光强6 000 lx、温度25 ℃的培养条件。选择MS+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂（pH 6.0）作为愈伤诱导及增殖的基本培养基。
1.2.3植物调节剂对小蓟叶片愈伤组织诱导。
单因素条件下，确定2，4D（0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.4、0.7、0.9、1.1、1.5 mg/L ）、NAA（0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L）对小蓟愈伤组织诱导影响；采用L9（34）正交设计，设置2，4D（0.6、0.8、1.0 mg/L）、6BA（0.7、0.9、1.1 mg/L）和NAA（1.5、2.0、2.5 mg/L）三因素三水平试验[7]，筛选最适宜的诱导培养条件。
选择长势良好的无菌苗叶片，剪成约5 mm×5 mm大小接种于不同的诱导培养基上，观察愈伤组织的生长状态，培养21 d后，统计愈伤组织重量诱导系数（愈伤组织重量/外植体接种重量）和诱导率。
1.2.4小蓟叶片愈伤组织增殖。
单因素条件下，确定2，4D（0、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）、6BA（0、0.1、0.3、0.5、0.8 mg/L）、NAA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）对小蓟愈伤组织增殖的影响及适宜条件。选择生长旺盛、有光泽的小蓟愈伤组织，剪成约6 mm×6 mm×6 mm大小接种于不同的愈伤组织增殖培养基上。培养21 d后，计算愈伤增殖率，观察愈伤组织状态，确定小蓟愈伤组织增殖适宜的激素浓度范围。
2结果与分析 2.1单因素条件下植物生长调节剂对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响
单因素结果显示（表1），2，4D对小蓟叶片愈伤组织诱导率最高，最早6 d即可诱导出愈伤组织；在0.4～2.0 mg/L范围内，诱导率为100%，愈伤组织呈白绿色，细胞透明度均较低；在0.8 mg/L条件下，21 d愈伤组织重量诱导系数最高，达46.91，愈伤组织生长状态最优。
6BA对愈伤组织诱导率一般，愈伤组织出现时间早于对照3～4 d；在0.4～1.5 mg/L范围内，均能诱导得到愈伤组织，质量较差，褐化严重；在0.9 mg/L条件下，21 d愈伤组织重量诱导系数最高，达15.09。
NAA对愈伤组织诱导率较好，愈伤组织出现时间早于对照4～5 d；在1.0～3.0 mg/L条件范围内，均能诱导得到愈伤组织，有褐化现象；在2.0 mg/L条件下，愈伤组织重量诱导系数最高，达26.65，愈伤组织出现的时间较短，生长状态较好。
2.2正交试验优化小蓟叶片愈伤组织诱导
正交试验结果显示，9种培养基对小蓟叶片愈伤组织均有较高诱导率，均达100%，愈伤组织呈白绿色或黄绿色，细胞透明度均较低（表2和图1）。
极差分析结果显示，NAA不同浓度重量诱导系数的极差最大，NAA对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响最大，3种植物生长调剂对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响主次顺序为NAA>6BA >2，4D。从诱导系数平均值分析可知，最佳愈伤诱导培养基组合为MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L。验证得到，该培养基中能获得最优诱导效果，愈伤组织呈白绿色，质地松软，愈伤组织重量诱导系数为113.06，为所有激素处理最高（图2）。
2.33种激素对小蓟叶片愈伤组织增殖的影响
单因素试验显示（表3），6BA对小蓟愈伤组织增殖效果较好，愈伤组织团较大，呈淡绿或绿色，细胞透明度均低，在0.3 mg/L条件下，愈伤组织增殖率最高；2，4D和NAA对小蓟愈伤组织增殖效果较差，愈伤组织团较小，诱导率低，呈白色或淡青色，较为松软，不适合小蓟愈伤组织的增殖培养。因此，确定MS+6BA 0.3 mg/L为小蓟愈伤组织增殖的最佳培养基。
3结论与讨论
MS培养基无机盐浓度较高，适合植物组织培养[8]。试验中选择MS培养基为基本培养基。植物调节剂是植物愈伤组织培养的关键因素。2，4D、6BA、NAA植物调节剂在一定范围内均能促进植物愈伤组织培养[7，9-10]。
2，4D、6BA、NAA 3种激素对小蓟愈伤组织诱导及增殖
均有不同程度的影响。单因素试验条件下，3种激素均能成
功诱导出小蓟叶片愈伤组织，最佳浓度分别是2，4D 0.8 mg/L、6BA 0.9 mg/L、NAA 2.0 mg/L，其中2，4D的诱导效果最佳，NAA对小蓟叶片愈伤组织诱导的影响最大。3种激素配合使用，在MS+2，4D 0.6 mg/L+6BA 0.9 mg/L+NAA 2.5 mg/L培养基中，诱导效果最好。在2，4D 和NAA单因素条件下，小蓟愈伤组织增殖率极低，有褐化现象，不适于增殖培養；6BA对小蓟愈伤组织增殖率相对较高，MS+6BA 0.3 mg/L培养基为愈伤组织增殖的最适条件。
参考文献
[1] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第一分册[M].北京：科学出版社，1991：569.
[2] 孟永海.小蓟的化学成分研究[D].佳木斯：黑龙江中医药大学，2007：4-5.
[3] 祁爱蓉，徐彩，蔡芬芳.小蓟、小蓟炭的主要成份及止血作用研究综述[J].内蒙古中医药，2012（20）：96-99.
[4] 李桂凤，万春燕，岳辉.野生蔬菜：刺儿菜营养价值与食疗方[J].东方食疗与保健，2004（10）：70.
[5] 王宏霞.波棱瓜种子萌发特性和组织培养研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008：25-26.
[6] 姜长阳.培养基琼脂用量的商榷[J].植物生理学通讯，1990，16（2）：53-54.
[7] 李代丽，康向阳.植物愈伤组织培养中内外源激素效应的研究现状与展望[J].生物技术通讯，2007，18（3）：546-548.
[8] 潘佑找，赵金萍，曾祥秒，等.野生乳头百合组织培养及快速繁殖研究[J].安徽农业科学，2011，39（14）：8256-8258.
[9] 王允威，刁毅.NAA与BA对康乃馨愈伤组织诱导的影响[J].广东化工，2012，39（10）：19-21.
[10] 李文静，李学强，贾毛毛，等.6BA、NAA和2，4D不同配比对荠菜愈伤组织诱导、生长及植株再生的影响[J].植物生理学报，2012，48（2）：141-146.