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摘要以病原微生物实验室检测为基础，与临床、病理相结合，将采集到乳样、粪样等样品利用选择及鉴别培养基对病原微生物进行分离与培养，结合革兰氏染色镜检、生化试验，并最终通过血清学鉴定的方法分离到宁夏地区奶牛致病性大肠杆菌的5个优势血清型。通过药敏试验，将结果及时反馈到牧场，为牧场的安全生产起到了积极的作用。
关键词奶牛；疾病；大肠杆菌；血清型；乳房炎
中图分类号S858.23文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-128-02
大肠埃希菌，俗称大肠杆菌，大多数为人和温血动物肠道内的正常菌群，人和动物出生后很快便可经口进入消化道内，大量繁殖而定居，终身伴随，并经粪便不断散播于周围环境[1]。因此，大肠杆菌在环境卫生和食品卫生学上作为食品被粪便污染的直接或间接指标。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，大小为（0.4～0.7）μm×（2～3）μm，两端钝圆，散在或成对，大多数菌株以周身鞭毛运动，但也有无鞭毛的变异株。大多数对人和动物致病的菌株还常有与毒力相关的特殊菌毛。某些菌株有荚膜或微荚膜。碱性染料对本菌有良好着色性，菌体两端偶尔略深染。大肠埃氏菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37 ℃，最适生长pH为7.2～7.4，麦康凯琼脂上形成红色菌落；在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落；在SS琼脂上一般不生长或生长较差，生长者呈红色。一些致病性菌株在绵羊血平板上呈β溶血。在营养琼脂上生长24 h后，形成圆凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落[2]。此菌能发酵多种碳水化合物并产酸产气。大多数菌株可迅速发酵乳糖和山梨醇，极少数迟发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖，几乎不产生硫化氢，不分解尿素。吲哚和甲基红试验结果均为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验结果均为阴性。大肠杆菌主要有O、K、H 3种抗原，均为菌体表面抗原，是该菌血清型鉴定的物质基础[3]。其中，O抗原有173种，K抗原有80种，H抗原有56种。
笔者以奶牛乳房炎及导致犊牛腹泻的致病性大肠杆菌（Escherichia coli）为研究对象，对宁夏区内各主要奶牛养殖区E.coli的病原学和流行病学开展研究，并在此基础上对分离的大肠杆菌针对O抗原进行血清型的分型与鉴定，分析宁夏主要奶牛养殖区E.coli优势血清型的流行与分布情况，以期为宁夏回族自治区防控大肠杆菌病提供重要的病原学及流行病学资料。
1材料与方法
1.1样本采集
主要针对腹泻犊牛和乳房炎成母牛进行样品采集，现场采集犊牛排泄物，必要时采集血液。采集乳房炎牛乳样和粪样，严重病例视情况采集血液、淋巴液、鼻腔拭子、关节液，部分病死牛剖解后只采集心肌、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、胃肠及某些淋巴结（如肠系膜淋巴结、肾门淋巴结）。
1.2方法
1.2.1样品处理。根据临床症状及牧场兽医的讲述并作记录，采集到具有诊断意义的样品，将采集的样品（包括组织样、血样、乳样、粪样及鼻腔拭子等）有针对性地分别接种于普通营养琼脂，麦康凯显色培养基和伊红美兰显色培养基上有必要时再接种血琼脂平板，置于细菌培养箱中在37 ℃和一定湿度条件下经过18～24 h培养后，根据菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度、和溶血性等对细菌作初步识别，然后挑取单一菌落通过革兰氏染色后镜检观察，同时挑取单个可疑菌落进行纯培养，直到获得单一菌株，以此进行形态学鉴定，收获保存。将单一疑似菌落接种至500 μl营养肉汤中置于灭菌的2 ml规格的冻存管中，放在水浴摇床上过夜培养后取出，在超净台中用60%的甘油与含有菌株的营养肉汤按2∶1的比例封存于2 ml的冻存管中，置于4 ℃冰柜中3～4 d后移入-20 ℃的环境中，以备后期进行生化鉴定、药敏试验并最终作出分型鉴定。
1.2.2革兰氏染色。
将纯培养后待冻存的菌液用革兰氏染色并法进行染色并镜检。 革兰氏染色法包括结晶紫初染1 min、革兰氏碘液媒染1～2 min、95%的酒精脱色30～40 s沙黄复染40～60 min，其中结晶紫配制时用蒸馏水配制。
1.2.3细菌生化试验。
细菌微量生化试验管，购自杭州天和微生物试剂有限公司，所采用的微量管有硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、靛基质、MR、枸橼酸盐、尿素、半固体、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、棉籽糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖，外加氧化酶。首先挑取伊红美蓝培养基上黑色金属样光泽的菌落于营养肉汤中过夜培养，然后进行氧化酶试验，阴性者再进行进一步生化鉴定，然后将氧化酶阴性者分别接种到各微量管中，根据细菌微量生化反应管结果判定表，对应地将反应结果记录在肠杆菌科GYZ-15e编码鉴定结果记录表中，然后对照肠杆菌科细菌生化鉴定编码册（第2代15e系统），依据编码做出判定。
1.2.4药敏试验。
将冻存的菌液取出复壮后进行体外抑菌试验[4]，采用药敏片法，所选药敏片也是根据牛场用药情况，部分为新选药物，以便指导临床用药，另一部分则为确认实验室工作与牛场实际工作中用药情况的一致性，因此选取的药敏片种类较多。所用药敏片的种类包括：β内酰胺类药物有头孢拉唑、头孢噻肟等；氨基糖苷类药物有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、新霉素等；四环素类药物有四环素、多西环素；大环内酯类药物泰乐菌素等。试验结果判定标准参照美国临床检验标准委员会（CLSD）制定的标准执行。
1.2.5O抗原分型鉴定。利用血清凝集试验进行大肠杆菌O抗原血清型分型鉴定。
2结果与分析
2.1病原菌的分离培养结果
在麦康凯培养基上菌落生长茂盛，呈红色菌落，圆形，边缘齐整，隆起较高，表面光滑，比较湿润，中等大小。伊红美兰琼脂培养基上菌落长势茂盛，呈黑色金属光泽，圆形，边缘齐整，隆起不高，表面光滑，中等大小。在血琼脂培养基上长出呈圆形、边缘齐整，表面光滑的单个菌落，并出现清晰的β溶血。 2.2革兰氏染色镜检
经过革兰氏染色后，在100倍油镜下可见视野中存在大量呈革兰氏阴性染色，两端钝圆的小杆菌，散在分布，偶尔可见革兰氏阴性中等大小的杆菌，无杂菌。
2.3药敏试验结果由于所涉及的大肠杆菌菌株较多，通过药敏结果2株大肠杆菌的抑菌圈直径见表1。
2.4生化试验结果
纯化的大肠杆菌菌株较多，10株大肠杆菌的生长试验结果见表2。通过对照肠杆菌科细菌生化鉴定编码册（第2代15e系统）后，所检测的10株菌株均为大肠杆菌，因此进一步确认了所用伊红美蓝培养基的可靠性。
3讨论
从前期处理并保存的229株大肠杆菌中，解冻复壮后经麦康凯和伊红美蓝培养基再次接种培养后、用革兰氏染色镜检将形态符合的菌株进行生化试验确定为大肠杆菌后，最终用30种O抗原血清型进行分型鉴定，结果表明共有78株分离菌株鉴定出血清型，另有4株发生自凝现象。同时，O10、O53、O92、O101、O158这5种血清型占参与分型样品的61.2%，其他血清型共占38.8%。因此，在银川地区奶牛O抗原血清型中以上5种为优势血清型，结合临床病例其影响不容忽视。
根据陆承平主编的《兽医微生物学》第4版中，目前大肠杆菌O抗原有170种，K抗原有80种，H抗原有56种。此次试验仅针对O抗原进行检测，除了以上5种优势血清型外，其他血清型虽然所占比例较小，但所占比例小不代表致病性弱，其危害性依然不可小视。从药敏试验结果来看，庆大霉素及头孢噻肟的作用效果较为明显，但是不同血清型的大肠杆菌其致病性和致病力不同[5]。以某些患牛在采样前已经
不同程度用药。这里仅作为参照说明大肠杆菌病在宁夏回族自治区的相关情况。建议牛场选用后，从部分牛只的治疗效果来看，通过药敏试验针对性地选择药物对疾病的治疗起到了积极的效果。后来有一些牧场发现连续用药3～5 d效果不再明显，经询问病牛之前也使用过这些药物或者同类药物，再次印证了在牧场实际生产工作中抗生素的使用容易引起耐药性的。大肠杆菌对多种药物敏感，但其敏感性易变，因此应注意合理用药。联合用药及轮换用药，为了准确选用敏感药物，定期对此牧场的大肠杆菌菌株进行药敏试验是有益的。因此，牧场不仅要对国家强制要求的重大疫病进行严格免疫，对于自场灭活苗、自场脏器苗等这些能有效预防奶牛乳房炎的措施也应当高度重视。密切关注奶牛健康情况，对一些发病的奶牛做到积极护理、妥善治疗。进一步加强并规范奶牛日常饲养管理工作[6]，使奶牛乳房炎频发、反复发作、隐性乳房炎激增、病死牛的突发、甚至重大传染病等问题得到有效控制。
参考文献
[1] 肖定汉.奶牛病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.
[2] 陈坤永，翁良树，吴慕贞，等. 深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验[J] .中国兽医科技， 1999， 29（9）：36-38.
[3] 邢玫，王振雄.规模化奶牛场奶牛乳房炎感染情况调查报告[J].新疆畜牧业，2007（3）：33-34.
[4] 杨萌萌，何生虎，郭磊.一起奶牛大肠杆菌病的诊断[J].动物医学进展，2012，33（10）：121-125.
[5] 钟荣珍，李建国，李树静，等.预防奶牛乳房炎的管理措施与营养调控[J].黑龙江畜牧兽医，2006（4）：27-28.
[6] 王运亨.奶牛的饲养管理[J].中国乳业，2003（3）：15-18.
关键词奶牛；疾病；大肠杆菌；血清型；乳房炎
中图分类号S858.23文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）28-128-02
大肠埃希菌，俗称大肠杆菌，大多数为人和温血动物肠道内的正常菌群，人和动物出生后很快便可经口进入消化道内，大量繁殖而定居，终身伴随，并经粪便不断散播于周围环境[1]。因此，大肠杆菌在环境卫生和食品卫生学上作为食品被粪便污染的直接或间接指标。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，大小为（0.4～0.7）μm×（2～3）μm，两端钝圆，散在或成对，大多数菌株以周身鞭毛运动，但也有无鞭毛的变异株。大多数对人和动物致病的菌株还常有与毒力相关的特殊菌毛。某些菌株有荚膜或微荚膜。碱性染料对本菌有良好着色性，菌体两端偶尔略深染。大肠埃氏菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37 ℃，最适生长pH为7.2～7.4，麦康凯琼脂上形成红色菌落；在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落；在SS琼脂上一般不生长或生长较差，生长者呈红色。一些致病性菌株在绵羊血平板上呈β溶血。在营养琼脂上生长24 h后，形成圆凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落[2]。此菌能发酵多种碳水化合物并产酸产气。大多数菌株可迅速发酵乳糖和山梨醇，极少数迟发酵或不发酵，约半数菌株不分解蔗糖，几乎不产生硫化氢，不分解尿素。吲哚和甲基红试验结果均为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验结果均为阴性。大肠杆菌主要有O、K、H 3种抗原，均为菌体表面抗原，是该菌血清型鉴定的物质基础[3]。其中，O抗原有173种，K抗原有80种，H抗原有56种。
笔者以奶牛乳房炎及导致犊牛腹泻的致病性大肠杆菌（Escherichia coli）为研究对象，对宁夏区内各主要奶牛养殖区E.coli的病原学和流行病学开展研究，并在此基础上对分离的大肠杆菌针对O抗原进行血清型的分型与鉴定，分析宁夏主要奶牛养殖区E.coli优势血清型的流行与分布情况，以期为宁夏回族自治区防控大肠杆菌病提供重要的病原学及流行病学资料。
1材料与方法
1.1样本采集
主要针对腹泻犊牛和乳房炎成母牛进行样品采集，现场采集犊牛排泄物，必要时采集血液。采集乳房炎牛乳样和粪样，严重病例视情况采集血液、淋巴液、鼻腔拭子、关节液，部分病死牛剖解后只采集心肌、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏、胃肠及某些淋巴结（如肠系膜淋巴结、肾门淋巴结）。
1.2方法
1.2.1样品处理。根据临床症状及牧场兽医的讲述并作记录，采集到具有诊断意义的样品，将采集的样品（包括组织样、血样、乳样、粪样及鼻腔拭子等）有针对性地分别接种于普通营养琼脂，麦康凯显色培养基和伊红美兰显色培养基上有必要时再接种血琼脂平板，置于细菌培养箱中在37 ℃和一定湿度条件下经过18～24 h培养后，根据菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度、和溶血性等对细菌作初步识别，然后挑取单一菌落通过革兰氏染色后镜检观察，同时挑取单个可疑菌落进行纯培养，直到获得单一菌株，以此进行形态学鉴定，收获保存。将单一疑似菌落接种至500 μl营养肉汤中置于灭菌的2 ml规格的冻存管中，放在水浴摇床上过夜培养后取出，在超净台中用60%的甘油与含有菌株的营养肉汤按2∶1的比例封存于2 ml的冻存管中，置于4 ℃冰柜中3～4 d后移入-20 ℃的环境中，以备后期进行生化鉴定、药敏试验并最终作出分型鉴定。
1.2.2革兰氏染色。
将纯培养后待冻存的菌液用革兰氏染色并法进行染色并镜检。 革兰氏染色法包括结晶紫初染1 min、革兰氏碘液媒染1～2 min、95%的酒精脱色30～40 s沙黄复染40～60 min，其中结晶紫配制时用蒸馏水配制。
1.2.3细菌生化试验。
细菌微量生化试验管，购自杭州天和微生物试剂有限公司，所采用的微量管有硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、靛基质、MR、枸橼酸盐、尿素、半固体、赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照、棉籽糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖，外加氧化酶。首先挑取伊红美蓝培养基上黑色金属样光泽的菌落于营养肉汤中过夜培养，然后进行氧化酶试验，阴性者再进行进一步生化鉴定，然后将氧化酶阴性者分别接种到各微量管中，根据细菌微量生化反应管结果判定表，对应地将反应结果记录在肠杆菌科GYZ-15e编码鉴定结果记录表中，然后对照肠杆菌科细菌生化鉴定编码册（第2代15e系统），依据编码做出判定。
1.2.4药敏试验。
将冻存的菌液取出复壮后进行体外抑菌试验[4]，采用药敏片法，所选药敏片也是根据牛场用药情况，部分为新选药物，以便指导临床用药，另一部分则为确认实验室工作与牛场实际工作中用药情况的一致性，因此选取的药敏片种类较多。所用药敏片的种类包括：β内酰胺类药物有头孢拉唑、头孢噻肟等；氨基糖苷类药物有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、新霉素等；四环素类药物有四环素、多西环素；大环内酯类药物泰乐菌素等。试验结果判定标准参照美国临床检验标准委员会（CLSD）制定的标准执行。
1.2.5O抗原分型鉴定。利用血清凝集试验进行大肠杆菌O抗原血清型分型鉴定。
2结果与分析
2.1病原菌的分离培养结果
在麦康凯培养基上菌落生长茂盛，呈红色菌落，圆形，边缘齐整，隆起较高，表面光滑，比较湿润，中等大小。伊红美兰琼脂培养基上菌落长势茂盛，呈黑色金属光泽，圆形，边缘齐整，隆起不高，表面光滑，中等大小。在血琼脂培养基上长出呈圆形、边缘齐整，表面光滑的单个菌落，并出现清晰的β溶血。 2.2革兰氏染色镜检
经过革兰氏染色后，在100倍油镜下可见视野中存在大量呈革兰氏阴性染色，两端钝圆的小杆菌，散在分布，偶尔可见革兰氏阴性中等大小的杆菌，无杂菌。
2.3药敏试验结果由于所涉及的大肠杆菌菌株较多，通过药敏结果2株大肠杆菌的抑菌圈直径见表1。
2.4生化试验结果
纯化的大肠杆菌菌株较多，10株大肠杆菌的生长试验结果见表2。通过对照肠杆菌科细菌生化鉴定编码册（第2代15e系统）后，所检测的10株菌株均为大肠杆菌，因此进一步确认了所用伊红美蓝培养基的可靠性。
3讨论
从前期处理并保存的229株大肠杆菌中，解冻复壮后经麦康凯和伊红美蓝培养基再次接种培养后、用革兰氏染色镜检将形态符合的菌株进行生化试验确定为大肠杆菌后，最终用30种O抗原血清型进行分型鉴定，结果表明共有78株分离菌株鉴定出血清型，另有4株发生自凝现象。同时，O10、O53、O92、O101、O158这5种血清型占参与分型样品的61.2%，其他血清型共占38.8%。因此，在银川地区奶牛O抗原血清型中以上5种为优势血清型，结合临床病例其影响不容忽视。
根据陆承平主编的《兽医微生物学》第4版中，目前大肠杆菌O抗原有170种，K抗原有80种，H抗原有56种。此次试验仅针对O抗原进行检测，除了以上5种优势血清型外，其他血清型虽然所占比例较小，但所占比例小不代表致病性弱，其危害性依然不可小视。从药敏试验结果来看，庆大霉素及头孢噻肟的作用效果较为明显，但是不同血清型的大肠杆菌其致病性和致病力不同[5]。以某些患牛在采样前已经
不同程度用药。这里仅作为参照说明大肠杆菌病在宁夏回族自治区的相关情况。建议牛场选用后，从部分牛只的治疗效果来看，通过药敏试验针对性地选择药物对疾病的治疗起到了积极的效果。后来有一些牧场发现连续用药3～5 d效果不再明显，经询问病牛之前也使用过这些药物或者同类药物，再次印证了在牧场实际生产工作中抗生素的使用容易引起耐药性的。大肠杆菌对多种药物敏感，但其敏感性易变，因此应注意合理用药。联合用药及轮换用药，为了准确选用敏感药物，定期对此牧场的大肠杆菌菌株进行药敏试验是有益的。因此，牧场不仅要对国家强制要求的重大疫病进行严格免疫，对于自场灭活苗、自场脏器苗等这些能有效预防奶牛乳房炎的措施也应当高度重视。密切关注奶牛健康情况，对一些发病的奶牛做到积极护理、妥善治疗。进一步加强并规范奶牛日常饲养管理工作[6]，使奶牛乳房炎频发、反复发作、隐性乳房炎激增、病死牛的突发、甚至重大传染病等问题得到有效控制。
参考文献
[1] 肖定汉.奶牛病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002.
[2] 陈坤永，翁良树，吴慕贞，等. 深圳地区奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验[J] .中国兽医科技， 1999， 29（9）：36-38.
[3] 邢玫，王振雄.规模化奶牛场奶牛乳房炎感染情况调查报告[J].新疆畜牧业，2007（3）：33-34.
[4] 杨萌萌，何生虎，郭磊.一起奶牛大肠杆菌病的诊断[J].动物医学进展，2012，33（10）：121-125.
[5] 钟荣珍，李建国，李树静，等.预防奶牛乳房炎的管理措施与营养调控[J].黑龙江畜牧兽医，2006（4）：27-28.
[6] 王运亨.奶牛的饲养管理[J].中国乳业，2003（3）：15-18.