黄连须根提取物生物碱类成分及抑菌活性研究

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  摘要 目的:在黃连的采收加工过程中,大量的黄连须作为农业废弃物而丢弃,为探索其在植物源农药方面的应用价值和前景,对黄连须根的化学成分及其含量进行测定,并对其提取物和单体成分进行活性筛选。方法:采用酸水提取,制备黄连须根提取物,采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对其生物碱类成分进行定性分析,指认黄连须根中的主要化学成分;采用一测多评方法,对其中的盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀等5个成分进行定量研究;采用抑菌圈法,评价须根提取物及部分单体成分对农业病原菌的抑制活性。结果:通过质谱指认了黄连须根酸水提取物中14种生物碱类成分,其中5种主要生物碱含量总和是6.9%~9.1%,其含量约为主根提取物的26%,具有开发利用价值。通过对黄连、须根2种提取物以及黄连须根中的主要成分盐酸黄连碱的活性筛选,发现黄连须根提取物在1、10、50、100 mg/L 4个浓度下对农业中常见病原菌(小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌、小麦纹枯病、番茄早疫病、苹果斑点落叶病、辣椒炭疽菌、水稻稻瘟病)抑制活性较弱,仅有黄连提取物在高浓度(100 mg/L)时对辣椒疫霉菌的抑制活性达50%,其余抑菌活性均低于50%。须根中的盐酸黄连碱在50 mg/L对辣椒疫霉菌、小麦纹枯病均具有较强的抑制活性(>80%),对水稻稻瘟病、辣椒炭疽菌也有较强的抑制活性,分别达71.43%和63.64%。结论:黄连须根中的生物碱成分含量较高,且对农业中常见病原菌有一定的抑制活性,尤其是盐酸黄连碱对辣椒疫霉菌、小麦纹枯病均具有较强的抑制活性,具备开发利用潜力,可以为黄连须根的综合利用提供依据。
  关键词 黄连;须根;生物碱;抑菌活性
  Study on Alkaloids and Antibacterial Activity of Fibrous Root Extract of Coptis Chinensis
  ZHANG Yongxin1,ZHU Tong1,2,YANG Dan1,TENG Fei1,ZHU Jingjing1,WANG Zhimin1,CHEN Liangmian1,GAO Huimin1,FENG Weihong1
  (1 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica, Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China; 2 School of Pharmary,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230012,China)
  Abstract Objective:During the harvesting and processing of Rhizoma Coptidis,a large number of Rhizoma Coptidis whiskers are discarded as agricultural wastes,in order to explore the application value and Prospect of Coptis whiskers in botanical pesticides,the chemical composition and content of Coptis whiskers were determined,and the activity of extracts and monomers were screened.Methods:In this study,the fibrous root extract of Rhizoma Coptidis was prepared by acid water extraction,the alkaloids were qualitatively analyzed by UPLC-q-TOF/MS,the main chemical components in the fibrous root extract of Rhizoma Coptidis were identified by combining reference substance with literature.The quantitative analysis of berberine hydrochloride,berberine hydrochloride,jatrorrhizine hydrochloride,epiberberine hydrochloride and palmatine hydrochloride was carried out by quantitative analysis of multi-components with single marker,and the inhibition activity of fibrous root extracts and some monomers against agricultural pathogens was evaluated by inhibition zone method.Results:A total of 14 alkaloids in the fibrous root extract of Rhizoma Coptidis were identified by mass spectrometry.The total content of 5 main alkaloids was 6.9%~9.1%,which was about 26% of the main root extract,and has development and utilization value.Through the active screening of the 2 extracts of Coptis root and fibrous roots,and the main component of Rhizoma Coptidis root--berberine hydrochloride,it was found that the extracts from Rhizoma Coptidis had significant inhibitory effect on common pathogenic bacteria in agriculture(Gibberella graminearum,Botrytis cinerea,Phytophthora capsici,Wheat Sheath Blight,Tomato early blight,Alternaria mali,Colletotrichum capsicum and rice blast) under four concentrations of 1 mg/L,10 mg/L,50 mg/L and 100 mg/L.Only the extract of Rhizoma Coptidis at high concentration(100 mg/L) had 50% inhibitory activity against Phytophthora capsici,and the other antibacterial activities were less than 50%.Berberine hydrochloride in fibrous roots had strong inhibitory activity against Phytophthora capsici and Wheat Sheath Blight(>80%) at 50 mg/L.It also had strong inhibitory activity against rice blast and Colletotrichum capsici,reaching 71.43% and 63.64% respectively.Conclusion:The content of alkaloids in the fibrous roots of Rhizoma Coptidis is still high,and it has certain inhibitory activity to the common pathogenic bacteria in agriculture,especially the strong inhibitory activity of berberine hydrochloride to Phytophthora capsici and sharp eyespot of wheat,which has the potential of development and utilization.The results of this study provide the basis for the comprehensive utilization of fibrous roots of Rhizoma Coptidis.   Keywords Rhizoma Coptidis; Fibrous root; Alkaloid; Bacteriostatic activity
  中图分类号:R284.1文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.007
  黄连作为大宗中药材,每年的产量和市场需求量均很大,黄连在产地加工时需要“除去须根及泥沙,干燥,撞去残留须根”,产生大量的须根作为农业废弃物被遗弃,不仅造成资源浪费而且污染环境。据统计,黄连亩产主根300 kg,须根50 kg。对黄连须根的综合利用,具有社会、经济和生态价值。黄连具有明显的抗菌作用,且抗菌谱较广[1-5]。1987—2017年发表的黄连抗菌研究文献有195篇,涉及45种细菌菌种,其有效成分主要为小檗碱、黄连碱和药根碱,目标菌主要为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、绿脓假单胞菌等,其中对金葡菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、淋病奈瑟氏菌及抗假丝酵母菌、白色念珠菌等的优势明显。
  我国作为人口大国和农业大国,粮食蔬菜的产量与质量关系着人民的生命质量。蔬菜、水果种植密度大,大棚、日光温室、露天蔬菜地之间交错进行,且空隙狭小,导致番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌、番茄早疫病、苹果斑点落叶病、辣椒炭疽菌等病菌肆意生长,严重影响蔬菜水果产量。致使在农药使用方面我国一直稳居世界榜首,据报道我国每年农药使用量约150万吨,大量、无序地使用高毒化学农药不仅会造成生态的巨大破坏,还会带来食品安全的巨大隐患,因此我国已颁布禁用了39种高毒高风险农药,随之生物农药的研发进入了一个新高潮。2017年统计数据显示,我国生物农药覆盖率已近10%,仍比發达国家低20%~30%。因此,从抗菌抗病毒中药的非药用部位中寻找新药源,研发高效低毒的生物农药具有很好的前景。
  本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术针对黄连须根开展化学成分比较研究,在此基础上,选取粮食、蔬菜和水果中发生危害严重的8种农业病原菌为筛选对象,开展黄连和须根提取物及黄连单体化合物的抑菌活性评价研究,考察以黄连须根废弃物为原料开发植物源农药的潜力,以期为黄连及其他中药材下脚料的综合利用寻找突破口。
  1 仪器与试药
  1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters公司,美国,型号:2695-2998);色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,AKZO NOBEL公司,瑞典,型号:Kromasil Etenity-5-C18);高效液相色谱仪(岛津公司,日本,型号:LC-20AT);液相色谱仪(Waters公司,美国,型号:ACQUITY UPLC);质谱仪(Waters公司,美国,型号:Xevo G2-SQ-Tof);旋转蒸发仪(BUCHI公司,瑞典,型号:R-220);数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ-250DB);数显电热套(上海力辰邦西仪器科技有限公司,型号:ZNHW-10 L);恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司,型号:HH-ZK8);万分之一电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司,型号:BSA124S];超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术公司,型号:YT-CJ-2ND);二氧化碳人工气候箱(宁波赛福实验仪器有限公司,型号:PRX-1000C-CO2)。
  1.2 试剂 硫酸(批号:20002760)、碳酸氢铵(批号:20002760)、甲酸(批号:20170803)、氨水(批号:1000211)、三乙胺(批号:80134318)购自国药集团化学试剂有限公司;乙腈(Fisher公司,美国,批号:172009),甲醇(北京化工厂,批号:20170322),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司,批号:20171004)。小麦赤霉病菌(Fusarium Graminearum Schw.)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia Cerealis Vander Hoeven)、番茄灰霉病菌(Botrytis Cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora Capsici)、辣椒炭疽病菌(Colletortrichum Gloeos Porioides)、苹果斑点落叶病菌(Alternaria Alternate f.sp.mali)、水稻稻瘟病菌(Piricularia Oryzae)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas Oryzae Pathovar Oryzicola),由北京依科世福科技有限公司试验室保存和培养。
  1.3 分析样品 黄连须根药材(湖北恩施,批号:202101/2017;重庆石柱,批号:202103);盐酸巴马汀(批号:110732-200907)、盐酸药根碱(批号:110733-201007)、盐酸小檗碱对照品(批号:11713-200911)购自中国药品生物制品鉴定所;盐酸黄连碱与盐酸表小檗碱对照品(中国中医科学院中药研究所自提,经HPLC面积归一化法测定,纯度≥98%)。
  2 方法
  2.1 黄连须根定性分析
  2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流速0.3 mL/min,进样量2 μL,检测波长200~700 nm,柱温30 ℃,以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)为流动相,梯度洗脱条件:0~5 min,10%~20% A;5~8 min,20%~25% A;8~11 min,25%~35% A;11~14 min,35%~99% A;14~15 min,99% A;15~15.5 min,99%~10% A;15.5~17.5 min,10% A。   2.1.2 质谱检测条件 电喷雾离子源,正负离子模式扫描,离子源温度120 ℃,雾化气为N2,质量扫描范围质荷比(m/z):100~1 200,累积时间0.2 s,锥孔电压40 V,毛细管电压2 kV,碎片离子碰撞能量20~50 eV,母离子碰撞能量6 eV,脱溶剂气流速600 L/h,锥孔气体流量50 L/h,脱溶剂气温度400 ℃,数据的采集和处理软件为Mass Lynx 4.1质谱工作站。
  2.1.3 供试品溶液的制备 取黄连须根粉末约2 g,精密称定,10倍量75%甲醇以250 W功率超声提取60 min,静置,取上清液过滤,过0.22 μm微孔滤膜,作为负离子模式下的供试品溶液。取滤液1 mL,加75%甲醇稀释10倍,作为正离子模式下的供试品溶液。
  2.1.4 黄连须根提取工艺 称取黄连须根600 g左右,加入10倍量0.3%硫酸溶液浸泡过夜(15 h左右),50 ℃左右浸提3次,2 h/次,过滤合并滤液,50 ℃减压回收溶剂至1 L左右,于水浴锅上50 ℃蒸至稠膏状并减压干燥(50 ℃,5 h),即得黄连须根提取物。
  2.2 黄连须根定量分析
  2.2.1 色谱条件 以乙腈为流动相A,以30 mmol/L碳酸氢铵溶液(每1 000 mL碳酸氢铵溶液含7 mL氨水,1 mL三乙胺)为流动相B,进行梯度洗脱:0~15 min,10%~20% A;15~25 min,20%~27% A;25~45 min,27%~30% A;45~50 min,30%~35% A;50~60 min;35%~100% A;柱温30 ℃;检测波长为270 nm;进样量10 μL。
  2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱4.78 mg于5 mL容量瓶中,甲醇定容,制成0.956 mg/mL的溶液,即得。
  2.2.3 供试品溶液的制备 分别取黄连与黄连须根提取物40 mg,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20 mL,称重,超声处理30 min。放冷,甲醇补重,滤过,取续滤液,即得提取物供试品溶液。分别取黄连与黄连须根粉末约0.2 g,精密称定,置于50 mL锥形瓶,精密加入甲醇-盐酸(100∶1)溶液50 mL,称重,超声30 min,冷却,加甲醇补足重量,滤过,取续滤液过0.45 μm滤膜,即得药材供试品溶液。
  2.2.4 线性关系考察 精密称取适量对照品,配成系列不同浓度的对照品溶液,分别进样10 μL,以进样量为自变量(x),峰面积为因变量(y),求得回归方程,结果表明,盐酸小檗碱在0.105~1.056 μg范围内,线性关系良好,y=3.178×106x-621.083(R2=0.999 9)。
  2.2.5 精密度试验 样品溶液连续进样5次,分别测定其峰面积,峰面积的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)值1.1%,說明精密度良好。
  2.2.6 供试品溶液的稳定性试验 样品溶液在制备后0、2、4、6、8、10、12、18、24、48 h测定,测得的峰面积变化趋势不明显,说明样品溶液在48 h内稳定。
  2.2.7 重复性试验 取同一批样品称重5份,分别依供试品溶液的制备方法操作,测得盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀的平均质量分数分别为0.79%,RSD分别为0.46%
  2.2.8 回收率试验 称取已知含量样品5份,分别加入对照品盐酸小檗碱适量,依供试品溶液的制备方法制备并测定。结果平均回收率为96.1%,RSD为1.1%,表明方法回收率良好。
  2.3 黄连须根对农业病原菌的抑菌活性评价
  2.3.1 抑菌圈法检测 对于病原真菌,采用NY/T1156.6-2006的平皿菌丝生长抑制法。将小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、苹果斑点落叶病菌、水稻稻瘟病菌在马铃薯蔗糖琼脂(Potato-Saccharose-Agar,PSA)平板上(25±1)℃预培养,待菌落快长满整个培养皿时,用直径为5 mm的打孔器在靠近菌落边缘的同一圆周上打取菌饼(保证同一重复的供试病菌的菌龄相同),并用接种针在无菌条件下将菌饼接种到带毒PSA培养基平板中央,菌丝面朝下,置于黑暗下培养。将一定量的水稻细菌性条斑病菌加入冷却至50 ℃左右的NA培养基中,混合均匀,倾注平板,水平静置凝固后备用。将已灭菌的牛津杯垂直置于试验平板上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙,往杯中注入设定浓度的待测样品0.2 mL后,在30 ℃的培养箱中培养18~24 h后,测定抑菌圈大小。
  2.3.2 供试药剂 黄连须根提取物、黄连提取物、盐酸黄连碱等所有提取物含量均以100%计,制成1.00×104 mg/L母液,置于4 ℃冰箱保存备用。培养基中有机溶剂最终含量不超过1%。
  2.3.3 数据统计 采用SPSS 18.0统计软件计算各植物提取物对病菌真菌的EC50及95%置信区间。抑菌圈法:在一定范围内,抑菌圈直径的平方或面积与药液浓度的对数呈直线函数关系,从而比较供试样品杀菌活性大小。
  抵制率(%)=d1-d2d1×100%
  EC50(理论)=a+bA+B
   注:d1=对照的菌落增长直径(mm);d2=处理的菌落增长直径(mm);A=a/EC50(a);B=b/EC50(b)
  3 结果
  3.1 黄连须根提取物生物碱类组成定性分析 依2.1.1与2.1.2方法,通过对照品与文献相结合[6-7],共鉴定出14个生物碱类成分。见图1,表1。同时采用HPLC技术,对黄连与黄连须根进行指纹图谱定性比较研究,结果表明,黄连不同部位生物碱的化学组成基本一致,各成分间含量比例有差异。同时采用一测多评方法,对其中盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸药根碱、盐酸表小檗碱、盐酸巴马汀等5个成分进行定量研究。分析黄连不同部位各生物碱含量发现,在黄连和黄连须根中,小檗碱含量最高,其次是表小檗碱和黄连碱,巴马汀、药根碱含量较低。主根与须根2个不同部位的几种生物碱总和约为:513.68 mg/mL,134.66 mg/mL。见图2。由此表明,须根中生物碱类成分含量是主根的26%,具有较高的应用价值。   3.2 黄连须根提取物生物碱定量分析 依据黄连药典含量测定方法,测定黄连须根提取物中5种生物碱的含量[8-9]。见表2。
  3.3 黄连不同部位提取物对农业病原菌抑菌活性评价 为了评估黄连须根提取物作为植物源农药的开发前景,本研究开展了黄连、须根2种提取物以及黄连须根中的主要成分盐酸黄连碱单体化合物在1、10、50、100 mg/L 4个浓度下对农业病原菌(小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、辣椒疫霉菌、小麦纹枯病、番茄早疫病、苹果斑点落叶病、辣椒炭疽菌、水稻稻瘟病)的抑制活性評价研究。研究结果发现,黄连提取物对上述农业病原菌的抑制活性较弱,只有黄连提取物高浓度(100 mg/L)对辣椒疫霉菌的抑制活性达50%,其余抑菌活性均低于50%,表明黄连提取物对上述农业中常见病原菌抑制活性较弱。单体化合物盐酸黄连碱对辣椒疫霉菌、小麦纹枯病均具有较强的抑制活性,在50 mg/L,时即能达到80%以上的活性;在50 mg/L时,盐酸黄连碱对水稻稻瘟病具有较强的抑制活性,活性达71.43%,对辣椒炭疽菌的抑制活性达63.64%。见表3。
  4 讨论
  黄连须根的提取工艺一方面借鉴了黄连提取的传统工艺,另一方面参考了大量文献。张宏川等[10]和付灵艳等[11]研究发现,黄连生物碱的提取与料液比、不同提取方法都有关,选用70%醇溶液比酸水提取效率高。但使用乙醇回流提取会使工业生产成本增加,在经济上不如用浓度为1.5%的硫酸提取合算[12]。因此,综合经济成本与提取效率,我们选取0.3%硫酸浸提工艺。该提取工艺也为寻找黄连新药用部位资源提供了理论基础,使黄连生产副产物的大幅度开发利用成为可能。
  文献报道,黄连提取物与黄连中生物碱成分对农业病原菌有一定的抑制作用。刘铁秋等[13]对20多种川产道地药材,比较了6种不同溶媒提取,结果发现在供试浓度为0.1 g/mL条件下,黄连等7味中药材的乙醇提取物抑菌率达100%。闫红豆[14]以苹果树腐烂病菌、苹果斑点落叶病菌、苹果轮纹病菌3种病原菌为供试菌种,测定了不同中药提取物对病原菌的生物活性,结果发现在提取物的浓度为0.01 g/mL时,黄连、丁香等4种中药材提取物对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用最为显著,抑制率均达到100%。可见黄连提取物的抑菌作用明显。针对黄连中的生物碱类成分小檗碱,杨平等[15]研究发现,小檗碱通过影响水稻细菌性条斑病菌Ⅱ型分泌系统和Ⅲ型分泌系统的功能、生物膜的形成以及胞外多糖的合成,从而影响病菌的致病力;通过影响水稻细菌性条斑病菌的能量代谢和破坏细胞结构来抑制水稻细菌性条斑病菌的生长。王如意[16]在筛选抑制番茄早疫病菌植物源药物的研究发现:小檗碱对番茄早疫病菌的抑制效果最好;同时发现小檗碱与黑胡椒水提物以不同比例(5∶1,2∶3)复配分别可产生协同增效作用和相加作用。本研究发现:盐酸黄连碱对辣椒疫霉菌、小麦纹枯病均具有较强的抑制活性。而黄连须根提取物中的小檗碱含量最高(37%),其次是盐酸黄连碱(35%),二者占总生物碱量的73%。黄连须根生物碱含量是黄连的26%,因此,如能将黄连须根提取物开发用于抑制农作物病原菌,不但能提高黄连的生物利用率,而且能改善农作物的生长环境。
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  (2021-08-06收稿 责任编辑:王明)
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目的分析喀什地区维吾尔族与汉族三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)患者的临床病理特征,探讨不同民族TNBC患者的临床特点。方法回顾性分析2015年1月到2018年12月喀什地区第二人民医院收治的42例TNBC患者的临床资料,根据民族分为维族和汉族2组,比较2组首次就诊年龄、TNM分期、淋巴结情况、Ki67表达情况、治疗完成情况及生存差异。结果42例TNBC患者中,维族占71.4%,汉族占28.6%。在发病年龄、TNM分期方面,维汉2组TNBC患者无明显差异(
通过立足健康专业媒体融合发展现状,聚焦业界创新实践,透过内容为王、开门办报、渠道为要的传播规律,研究MCN多渠道网络现象背后的媒体逻辑;探索专业化整合、轻量化投入、模块化保障,解决内容生产难、资金保障难、全媒体人才培养难等瓶颈问题;尝试运用MCN多渠道网络模式,延伸内容价值增长链条,提升媒体内容生产、全媒传播、用户服务能力。采取“内容+政务”“内容+商务”“内容+服务”的办法,落地MCN多渠道网络项目,打造“新闻IP”“健康IP”“活动IP”服务品牌,推动媒体内容持续优化、平台持续扩大、渠道持续丰富、品牌
目的研究lncRNAs PCAT-1在宫颈癌细胞顺铂(DDP)耐药中的作用及调控机制。方法荧光定量PCR分析PCAT-1在人宫颈癌细胞株(HeLa与SiHa)与DDP耐药细胞株(HeLa/DDP与SiHa/DDP)中的表达。在HeLa/DDP与SiHa/DDP细胞中干扰与过表达PCAT-1,CCK-8与流式细胞术分别检测细胞生存能力及周期。蛋白质印迹法检测STAT3与PTEN的蛋白表达。结果HeLa/DDP细胞对HeLa细胞的DDP耐药指数为4.49,而SiHa/DDP细胞对SiHa细胞的DDP耐药指数为
儒家哲学与文化自创始以来,其内部一直藏含着经典诠释的发展理路。《论语》是儒家诠释之渊薮,汉、宋学者对此曾有过诸多讨论。其中,朱熹兼采汉宋,推陈出新,有别他者。以朱子诠释《论语》“亲亲相隐”为例,试寻看朱熹经典诠释之法。朱子通过“训诂考据”与“义理”并举、“生命与文化融合的体知”的诠释法,成功地纠正了“汉宋之弊”,实现排佛辟老、挺立儒学之目的,使得“天理”“人情”的理学命题内化于先秦经典中,回向至“性与天道”理学议题处,这也使生命的学问(成己)与学问的生命(成物)贯通浃恰,彰显儒家文化生命力。
目的探讨缺血性脑小血管病(CSVD)患者血清碱性磷酸酶(ALP)及血清胱抑素C(CysC)水平的变化并分析与认知功能障碍的相关性。方法选择2019年3月—2020年2月本院神经内科收治的缺血性CSVD患者72例作为研究对象,根据蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分将缺血性CSVD患者分为认知障碍组(37例)与认知正常组(35例)两组;另选取35名本院同期门诊健康体检者作为对照组。比较三组的血清ALP、CysC水平变化,并分析缺血性CSVD患者血清ALP、CysC水平与认知功能障碍的相关性。结果认知正常组的