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摘要：目的：为了能够更好的控制外伤如意膏制剂的中盐酸小檗碱的含量，本文就HPLC测定外伤如意膏中盐酸小檗碱的含量进行了浅显的研究和探讨。
方法：高效液相色谱法，采用CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）为流动相，流速为1 ml/min，柱温为30℃，检测波长为265 nm。
结果：当盐酸小檗碱的含量控制在0.0503μg～0.4026μg范围之内时，与峰面积的线性关系最为理想，r=1，平均回收率为98.4%，相对标准偏差值（RSD）=2.2%（n=9）。
结论：HPLC法应用于外伤如意膏中盐酸小檗碱含量测定的操作便捷，精准性高，值得推广。
关键词：高效液相色谱法 外伤如意膏 盐酸小檗碱
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0009-02
外伤如意膏由紫草、地榆、栀子、大黄、黄芩、黄柏、冰片等七味中药制成的中药复方制剂，具有清热解毒，凉血散瘀，消肿止痛，止血生肌。用于跌打撞伤，骨折脱臼，筋伤积瘀，皮肉损伤化脓，烫火伤等。为了能够更好的控制如意膏中盐酸小檗碱的含量，保证其临床效果的最大发挥，本文就高效液相色谱法测定外伤如意膏中盐酸小檗碱含量的实际效果进行了测定，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器。Waters高效液相色谱仪，包括Waters2487紫外检测器、Waters2695色谱工作站；本次研究活动中所采用的色谱柱均选择由杭州中拓仪器有限公司生产的CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱；密理博Milli-Qcentury纯水柱；SARTORIUS BSA-CW系列（全自动内校）分析天平BSA124S-CW；昆山舒美KQ-300超声波清洗器（外形尺寸（mm）：320×264×320，内槽尺寸（mm）：300×240×150，容量（L）：10，超声频率（KHz）：40，超声功率（W）：300）。
1.2 试药。盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检验所，供含量测定用，批号110713-200911，含量86.8%）；外伤如意膏（佛山冯了性药业有限公司提供，批号：UG0001、UF0004、UF0006）；甲醇、盐酸、十二烷基磺酸钠等均为分析纯；HPLC用乙腈为色谱纯；均选用超纯水作为本次研究活动中HPLC用水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件。色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（型号规格：S5 4.6*150/S5 4.6*250）。流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55）（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）；流速：1.0 ml/min；检测波长：265nm；柱温：30℃；进样量：本次研究活动中所使用的对照品溶液为10μl，使用的供试品溶液为10μl。
2.2 溶液的制备。
2.2.1 在制作对照品溶液时只需取适量的盐酸小檗碱，经过精密的称量后，加入适量的甲醇当中，制成每1毫升中含有56.9微克的溶液即可得出。
2.2.2 在制作供试品溶液时，取2-3克样品，经过精密的称量后，加入盐酸-甲醇（1∶100）25ml，称重，加热回流30分钟，放冷，称重，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液将失去的重量补足，滤过，取续滤液，即可。
2.2.3 阴性对照溶液的制作过程中需要严格按照处方中列出的比例和具体的操作
步骤，制作出不含黄柏的阴性对照样品，按照本文中2.2.2一项中的制作方式对阴性对照溶液进行制作即可。
2.3 系统适用性试验。分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样。结果：供试品及盐酸小檗碱对照品在经过处理后相应的位置上均出现了色谱峰，供试品色谱中的分离度明显优于盐酸小檗碱色谱中的分离度；阴性对照组在相应的部位上并未出现色谱峰，从中，我们不难发现，阴性对照溶液对样品的测定并不具有干扰作用。详细情况将图1。
2.4 线性关系考察。精密吸取20.13μg/ml盐酸小檗碱对照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μl，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程y = 4375x - 631.64（r=1）。结果表明，当盐酸小檗碱的进样量控制在50.3ng～402.6ng范围内时与峰面积呈现的线性关系最为理想。
2.5 精密度试验。精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，每次 10μl，测定盐酸小檗碱峰面积。结果RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验。精密吸取同一份供试品溶液（批号UG0001），分别在0、6、12、16、24h依次进样，测定盐酸小檗碱峰面积。结果RSD为0.2%，表明供试品溶液在24h内测定稳定性良好。
2.7 重复性试验。在进行重复性试验时，需要从同一批次的样品中制备成6份样品，按照相关的操作步骤将其制作成供试品溶液；同时，按照相关的色谱条件进行测定，得出样品含量平均值为0.1481mg/g，RSD为0.3%，结果表明，本方法的重复性较好。
2.8 加样回收率试验。
2.8.1 对照品溶液的制备。取适量的盐酸小檗碱，经过精密的称量后，加入适量的甲醇当中，制成每1毫升中含有56.9微克的溶液即可得出。
2.8.2 供试品溶液的制备 取已知含量的同一批（批号UF0004、0.1481mg/ml）样品9份，分为高中低三组，每组三份，分别取样1.2g、1.0g、0.8g，精密称定，置100ml锥形瓶中，分别加入2.8.1中盐酸小檗碱对照品3ml、2.5ml和2ml，按“2.2.2”项下方法操作，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。
3 讨论
参考《中国药典》2010版一部[1]“黄柏”中盐酸小檗碱含量测定项下的流动相，以乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55）（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）为流动相。
曾试用CAPCELL PAK C18、Phenomenex C18、Thermo C18三种品牌的色谱柱，结果三种品牌的色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离理想，本次研究活动中所选择的色谱柱为CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱。
在实验中选用盐酸-甲醇（1∶100）作为提取溶剂进行，在实验中选用超声30分钟、加热回流30分钟和加热回流60分钟进行比较，结果表明加热回流30分钟比超声处理30分钟要好，且与加热回流60分钟相差不大，故选用加热回流30分钟作为供试品溶液的制备方法。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版一部北京：中国医药科技出版社，2010.01：286-287
[2] 祝晨，林朝展，莫建霞.HPLC 法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量[J]中药新药与临床药理，2004，7（15）：262
[3] 范积平，张贞良，廖晓玲不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定广东药学院学报，2010，26（1）：54-57
[4] 祝晨，林朝展，莫建霞.黄柏HPLC指纹图谱鉴别研究[J]中药新药与临床药理，2003，9（14）：324-327
方法：高效液相色谱法，采用CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）为流动相，流速为1 ml/min，柱温为30℃，检测波长为265 nm。
结果：当盐酸小檗碱的含量控制在0.0503μg～0.4026μg范围之内时，与峰面积的线性关系最为理想，r=1，平均回收率为98.4%，相对标准偏差值（RSD）=2.2%（n=9）。
结论：HPLC法应用于外伤如意膏中盐酸小檗碱含量测定的操作便捷，精准性高，值得推广。
关键词：高效液相色谱法 外伤如意膏 盐酸小檗碱
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）04-0009-02
外伤如意膏由紫草、地榆、栀子、大黄、黄芩、黄柏、冰片等七味中药制成的中药复方制剂，具有清热解毒，凉血散瘀，消肿止痛，止血生肌。用于跌打撞伤，骨折脱臼，筋伤积瘀，皮肉损伤化脓，烫火伤等。为了能够更好的控制如意膏中盐酸小檗碱的含量，保证其临床效果的最大发挥，本文就高效液相色谱法测定外伤如意膏中盐酸小檗碱含量的实际效果进行了测定，现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器。Waters高效液相色谱仪，包括Waters2487紫外检测器、Waters2695色谱工作站；本次研究活动中所采用的色谱柱均选择由杭州中拓仪器有限公司生产的CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱；密理博Milli-Qcentury纯水柱；SARTORIUS BSA-CW系列（全自动内校）分析天平BSA124S-CW；昆山舒美KQ-300超声波清洗器（外形尺寸（mm）：320×264×320，内槽尺寸（mm）：300×240×150，容量（L）：10，超声频率（KHz）：40，超声功率（W）：300）。
1.2 试药。盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检验所，供含量测定用，批号110713-200911，含量86.8%）；外伤如意膏（佛山冯了性药业有限公司提供，批号：UG0001、UF0004、UF0006）；甲醇、盐酸、十二烷基磺酸钠等均为分析纯；HPLC用乙腈为色谱纯；均选用超纯水作为本次研究活动中HPLC用水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件。色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（型号规格：S5 4.6*150/S5 4.6*250）。流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55）（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）；流速：1.0 ml/min；检测波长：265nm；柱温：30℃；进样量：本次研究活动中所使用的对照品溶液为10μl，使用的供试品溶液为10μl。
2.2 溶液的制备。
2.2.1 在制作对照品溶液时只需取适量的盐酸小檗碱，经过精密的称量后，加入适量的甲醇当中，制成每1毫升中含有56.9微克的溶液即可得出。
2.2.2 在制作供试品溶液时，取2-3克样品，经过精密的称量后，加入盐酸-甲醇（1∶100）25ml，称重，加热回流30分钟，放冷，称重，用盐酸-甲醇（1∶100）溶液将失去的重量补足，滤过，取续滤液，即可。
2.2.3 阴性对照溶液的制作过程中需要严格按照处方中列出的比例和具体的操作
步骤，制作出不含黄柏的阴性对照样品，按照本文中2.2.2一项中的制作方式对阴性对照溶液进行制作即可。
2.3 系统适用性试验。分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样。结果：供试品及盐酸小檗碱对照品在经过处理后相应的位置上均出现了色谱峰，供试品色谱中的分离度明显优于盐酸小檗碱色谱中的分离度；阴性对照组在相应的部位上并未出现色谱峰，从中，我们不难发现，阴性对照溶液对样品的测定并不具有干扰作用。详细情况将图1。
2.4 线性关系考察。精密吸取20.13μg/ml盐酸小檗碱对照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μl，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程y = 4375x - 631.64（r=1）。结果表明，当盐酸小檗碱的进样量控制在50.3ng～402.6ng范围内时与峰面积呈现的线性关系最为理想。
2.5 精密度试验。精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，每次 10μl，测定盐酸小檗碱峰面积。结果RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验。精密吸取同一份供试品溶液（批号UG0001），分别在0、6、12、16、24h依次进样，测定盐酸小檗碱峰面积。结果RSD为0.2%，表明供试品溶液在24h内测定稳定性良好。
2.7 重复性试验。在进行重复性试验时，需要从同一批次的样品中制备成6份样品，按照相关的操作步骤将其制作成供试品溶液；同时，按照相关的色谱条件进行测定，得出样品含量平均值为0.1481mg/g，RSD为0.3%，结果表明，本方法的重复性较好。
2.8 加样回收率试验。
2.8.1 对照品溶液的制备。取适量的盐酸小檗碱，经过精密的称量后，加入适量的甲醇当中，制成每1毫升中含有56.9微克的溶液即可得出。
2.8.2 供试品溶液的制备 取已知含量的同一批（批号UF0004、0.1481mg/ml）样品9份，分为高中低三组，每组三份，分别取样1.2g、1.0g、0.8g，精密称定，置100ml锥形瓶中，分别加入2.8.1中盐酸小檗碱对照品3ml、2.5ml和2ml，按“2.2.2”项下方法操作，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。
3 讨论
参考《中国药典》2010版一部[1]“黄柏”中盐酸小檗碱含量测定项下的流动相，以乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55）（每100ml加十二烷基磺酸钠0.1g）为流动相。
曾试用CAPCELL PAK C18、Phenomenex C18、Thermo C18三种品牌的色谱柱，结果三种品牌的色谱柱所得待测成分色谱峰峰形好，分离理想，本次研究活动中所选择的色谱柱为CAPCELL PAK C18 MGⅡ色谱柱。
在实验中选用盐酸-甲醇（1∶100）作为提取溶剂进行，在实验中选用超声30分钟、加热回流30分钟和加热回流60分钟进行比较，结果表明加热回流30分钟比超声处理30分钟要好，且与加热回流60分钟相差不大，故选用加热回流30分钟作为供试品溶液的制备方法。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版一部北京：中国医药科技出版社，2010.01：286-287
[2] 祝晨，林朝展，莫建霞.HPLC 法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量[J]中药新药与临床药理，2004，7（15）：262
[3] 范积平，张贞良，廖晓玲不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定广东药学院学报，2010，26（1）：54-57
[4] 祝晨，林朝展，莫建霞.黄柏HPLC指纹图谱鉴别研究[J]中药新药与临床药理，2003，9（14）：324-327