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摘 要：将12尾草鱼置于添加有2.5mg/L浓度的五倍子水体中饲养25d，在试验前和试验第5d、10d、15d、20d、25d分别测定草鱼的白细胞数量、过氧化氢酶活性和碱性磷酸酶活性。结果表明：草鱼白细胞数量随时间延长先增加后减少，在第20d达到最大值4.55×104个/mm3；血清过氧化氢酶活性变化不明显，在1.63～1.80U/mL内波动；血清碱性磷酸酶活性随时间延长而先升高后降低，在第20d达到最大值8.37金氏/100mL。
关键词：五倍子；草鱼；白细胞；过氧化氢酶；碱性磷酸酶
中图分类号 S965.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）11-132-02
Abstract：12 grass carp were cultured in water with addition of 2.5mg/L of gallnut. Before the test and on the 5d，20d， 15th，20th，and 25d the leukocyte number，activity of serum catalase and alkaline phosphatase of were determined. Results showed that the number of leukocyte of grass carp increased first and then decreased with prolonging of time，and on the 20d it reached the maximum value of 4.55×104/mm3；the change of catalase activity was not significantly，varying from 1.63 to 1.80U/mL；alkaline phosphatase activity increased first and then decreased， and reached the maximum 8.37 Guinness /100mL on the 20d.
Key words：Gallnut；Grass carp；Leukocyte；Catalase；Alkaline phosphatase
草鱼肉质鲜嫩，营养价值高，饲料来源广，生长速度快，是我国池塘、水库养殖的主要品种之一。但由于池塘水环境、饲料及饲养管理水平等诸多因素的影响，造成草鱼养殖中病害频发，死亡率高，抗生素、促生长剂、杀虫药等的大量使用，造成药物在鱼体内大量富集残留和病原体的抗药性等不良后果，使水产品质量下降，既危害了人类健康，又污染了环境，严重影响了草鱼池塘养殖业的健康发展和经济效益的提高。安全生产无公害水产品已经成为水产养殖业可持续发展的关键[1]。中草药具有来源广泛、价廉效优、毒副作用小、抗药性不显著、不易形成机体药物残留和影响水产品质量、提高水产动物免疫力和抗病力等优点，在我国养殖业集约化追求绿色、环保、生态的浪潮推动下，其以提高免疫功能方面的独特优势，得到了越来越普遍的推广和应用，在水产养殖中具有重要意义[2]。
五倍子为五倍子蚜寄生于盐肤木、青麸杨、红麸杨上而形成的虫瘿；主要成分为没食子酸和鞣酸，抗菌范围广，是用于治疗水产动物细菌性疾病的外用药[3]。五倍子作为水产动物药物的报道较多，但多集中在其抗菌活性方面。如郑曙明等对复方五倍子有效成分进行了分离鉴定及抑菌活性研究 [4]；姜蕾等研究了五倍子对3种致病菌的体外抑菌效果和对鱼体急性毒性试验，得出五倍子具有较强的抑菌杀菌效果[5]。但有关五倍子对草鱼免疫机能影响的报道很少，本文主要探究五倍子对草鱼白细胞数量、血清过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）活性的影响。
1 材料与方法
1.1 试验鱼 试验用草鱼12尾，购自西昌市场，鱼体健壮，体长15±1.5cm，体重70±3g。
1.2 试验药品 五倍子药剂：称取五倍子2g，加水煎煮20min熬制成1L药液（浓度为2 000mg/L），药液装入密闭的试剂瓶中，置于冰箱4℃保存。10%草酸钾溶液，白细胞稀释液等。
1.3 试验仪器 722型分光光度计、75BG型紫外可见光分光光度计、HHW-600型恒温水箱、可调微量进样器、RJ-TGL-16GA型高速冷冻离心机。
1.3 试验鱼的饲养管理 将12尾草鱼暂养在60cm×45cm×45cm规格的鱼缸中，水深30cm，水温21～24℃，暂养2d后开始试验。采用多次给药方式，将五倍子药液泼洒于鱼缸中浸泡鱼体，试验期间五倍子浓度保持在2.5mg/L，每5d采用虹吸法換1/3水并补充药量至初始浓度，同时加入事先曝气48h的自来水至30cm处。试验期间不投饵，试验前及试验开始后第5d、10d、15d、20d、25d分别测定草鱼的白细胞数量、血清过氧化氢酶活性和碱性磷酸酶活性。
1.4 草鱼白细胞数量、CAT及AKP活性的测定
1.4.1 白细胞计数 每次取鱼2尾，采用断尾采血法，将血滴在有0.3mL10%草酸钾溶液的小烧杯中，混匀，制成抗凝血；用微量吸管吸取20μL抗凝血加入对应的白细胞稀释液中，轻轻摇匀备用；将白细胞悬浊液充入计数池，室温中平放3min待细胞下沉后于高倍镜下下计数。计数四角大方格内白细胞总数。计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4=0.4mm3，稀释倍数为稀释液体积8mL÷血0.02mL=40倍，计数公式如下：
血液白细胞数（个/mm3）=4个大方格中白细胞数×稀释倍数÷4个大方格容积
1.4.2 酶活性测定 每次取鱼2尾采血，在4℃以3000r/min离心10min，制得血清备用。过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用Bruno Stellmach的紫外分光光度法[6]；碱性磷酸酶（AKP）活性的测定采用标准曲线法[6]。 2 结果与分析
2.1 五倍子对草鱼白细胞数量的影响 五倍子对草鱼白细胞数量的影响见表1。在试验后20d内白细胞数量呈递增的趋势，在第20d达到最大值，为4.55×104个/mm3，在第25d白细胞数目略有下降，为3.96×104个/mm3，但仍高于试验前数量。说明2.5mg/L浓度的五倍子对草鱼白细胞数量的增加有一定的促进作用。
2.3 五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性的影响 五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性的影响见表3。试验前，草鱼血清碱性磷酸酶活性为7.26金氏/100mL；在试验的前15d草鱼血清碱性磷酸酶活性逐渐高，并在第15d达到最大值，为8.37金氏/100mL；15d后，草鱼血清碱性磷酸酶活性有所降低，在第20d降为7.89金氏/100mL，在第25d降为7.65金氏/100mL，但整体而言，施药后草鱼血清碱性磷酸酶活性比施药前有所升高，由此说明，2.5mg/L浓度的五倍子能够一定程度地提高草鱼血清碱性磷酸酶活性。
3 讨论
（1）我国五倍子产量较大，分布很广，便于大规模开发生产，同时五倍子作为传统中药积累了大量的药物配方，五倍子在水产养殖中主要为外用药，施药方便。可以预见，随着五倍子各种活性物质的不断发现和作用机理的明晰，其在水产养殖上的应用前景将会越来越广阔，必将产生巨大的经济效益和社会效益[7]。
（2）白细胞是鱼类体内一种能吞噬异物、具有免疫和自我保护能力的物质，当鱼类生存的外界环境发生变化，为抵御外来毒害以及更好的适应环境，就会出现白细胞数目大量增多的现象[8]。本试验中草鱼白细胞数目随时间的变化有所增加，在0d～20d呈逐渐上升趋势，在20d数目达到最大值，在第25d有所下降，这说明2.5mg/L濃度的五倍子对草鱼白细胞数目的增加有一定的促进作用，从而提高鱼体免疫机能，达到预防疾病的效果。
（3）过氧化氢酶（CAT）能将细胞代谢所产生的H2O2迅速加以清除，从而保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白 [1]。本试验中CAT活性虽在第10d和第20d有不同程度的提高，总体来说，五倍子对草鱼血清CAT活性影响不明显。
（4）碱性磷酸酶（AKP）几乎存在于身体各种组织中，是膜结合酶，在肠上皮、肾小管、成骨细胞、肝脏及白细胞中尤其丰富。血清中AKP主要来源于肝和骨髓。AKP活性的测定对于机体免疫功能的探究和疾病的预防具有非常重要的意义[1]。本试验中，在第0d～第15d草鱼血清碱性磷酸酶活性有一定程度的提高，在第15d达到最大值，为8.37金氏/mL，在第20d和第25d有所下降。2.5mg/L浓度的五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性有一定的促进作用。
参考文献
[1]李赫，宋文华，于翔.几种免疫增强剂对草鱼SOD、CAT 及 AKP活性的影响[J].水产学杂志，2010，23（4）：6-9.
[2]齐遵利，张秀文，韩叙.中草药对水产动物免疫促进作用的研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（20）：10 734-10 736.
[3]姜蕾， 郑曙明.五倍子对鲤鱼细菌性败血症的药效试验初报[J].中国农学通报， 2006，22（5）：460-464.
[4]郑曙明，黄建军，吴青等.复方五倍子有效成分的分离鉴定及抑菌活性研究[J].水生生物学报， 2010，34（1）：57-64.
[5]姜蕾， 郑曙明.五倍子对3种致病菌的体外抑菌和急性毒性试验[J].水利渔业，2005，25（6）：89-90.
[6]Bruno Stellmach（钱嘉渊 译）酶的测定方法[M].北京：中国轻工业出版社，1992：168-194.
[7]李秀萍，李春远，渠桂荣等.五倍子的研究概况[J].中医药学报，2002，30（3）：72-74.
[8]田娟，冷向军，李小勤，等.复方中草药制剂对草鱼生长性能、肌肉成分和血清非特异性免疫的影响[J].安徽农业科学，2008，36（28）：12 282-12 284. （责编：张长青）
关键词：五倍子；草鱼；白细胞；过氧化氢酶；碱性磷酸酶
中图分类号 S965.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）11-132-02
Abstract：12 grass carp were cultured in water with addition of 2.5mg/L of gallnut. Before the test and on the 5d，20d， 15th，20th，and 25d the leukocyte number，activity of serum catalase and alkaline phosphatase of were determined. Results showed that the number of leukocyte of grass carp increased first and then decreased with prolonging of time，and on the 20d it reached the maximum value of 4.55×104/mm3；the change of catalase activity was not significantly，varying from 1.63 to 1.80U/mL；alkaline phosphatase activity increased first and then decreased， and reached the maximum 8.37 Guinness /100mL on the 20d.
Key words：Gallnut；Grass carp；Leukocyte；Catalase；Alkaline phosphatase
草鱼肉质鲜嫩，营养价值高，饲料来源广，生长速度快，是我国池塘、水库养殖的主要品种之一。但由于池塘水环境、饲料及饲养管理水平等诸多因素的影响，造成草鱼养殖中病害频发，死亡率高，抗生素、促生长剂、杀虫药等的大量使用，造成药物在鱼体内大量富集残留和病原体的抗药性等不良后果，使水产品质量下降，既危害了人类健康，又污染了环境，严重影响了草鱼池塘养殖业的健康发展和经济效益的提高。安全生产无公害水产品已经成为水产养殖业可持续发展的关键[1]。中草药具有来源广泛、价廉效优、毒副作用小、抗药性不显著、不易形成机体药物残留和影响水产品质量、提高水产动物免疫力和抗病力等优点，在我国养殖业集约化追求绿色、环保、生态的浪潮推动下，其以提高免疫功能方面的独特优势，得到了越来越普遍的推广和应用，在水产养殖中具有重要意义[2]。
五倍子为五倍子蚜寄生于盐肤木、青麸杨、红麸杨上而形成的虫瘿；主要成分为没食子酸和鞣酸，抗菌范围广，是用于治疗水产动物细菌性疾病的外用药[3]。五倍子作为水产动物药物的报道较多，但多集中在其抗菌活性方面。如郑曙明等对复方五倍子有效成分进行了分离鉴定及抑菌活性研究 [4]；姜蕾等研究了五倍子对3种致病菌的体外抑菌效果和对鱼体急性毒性试验，得出五倍子具有较强的抑菌杀菌效果[5]。但有关五倍子对草鱼免疫机能影响的报道很少，本文主要探究五倍子对草鱼白细胞数量、血清过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（AKP）活性的影响。
1 材料与方法
1.1 试验鱼 试验用草鱼12尾，购自西昌市场，鱼体健壮，体长15±1.5cm，体重70±3g。
1.2 试验药品 五倍子药剂：称取五倍子2g，加水煎煮20min熬制成1L药液（浓度为2 000mg/L），药液装入密闭的试剂瓶中，置于冰箱4℃保存。10%草酸钾溶液，白细胞稀释液等。
1.3 试验仪器 722型分光光度计、75BG型紫外可见光分光光度计、HHW-600型恒温水箱、可调微量进样器、RJ-TGL-16GA型高速冷冻离心机。
1.3 试验鱼的饲养管理 将12尾草鱼暂养在60cm×45cm×45cm规格的鱼缸中，水深30cm，水温21～24℃，暂养2d后开始试验。采用多次给药方式，将五倍子药液泼洒于鱼缸中浸泡鱼体，试验期间五倍子浓度保持在2.5mg/L，每5d采用虹吸法換1/3水并补充药量至初始浓度，同时加入事先曝气48h的自来水至30cm处。试验期间不投饵，试验前及试验开始后第5d、10d、15d、20d、25d分别测定草鱼的白细胞数量、血清过氧化氢酶活性和碱性磷酸酶活性。
1.4 草鱼白细胞数量、CAT及AKP活性的测定
1.4.1 白细胞计数 每次取鱼2尾，采用断尾采血法，将血滴在有0.3mL10%草酸钾溶液的小烧杯中，混匀，制成抗凝血；用微量吸管吸取20μL抗凝血加入对应的白细胞稀释液中，轻轻摇匀备用；将白细胞悬浊液充入计数池，室温中平放3min待细胞下沉后于高倍镜下下计数。计数四角大方格内白细胞总数。计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4=0.4mm3，稀释倍数为稀释液体积8mL÷血0.02mL=40倍，计数公式如下：
血液白细胞数（个/mm3）=4个大方格中白细胞数×稀释倍数÷4个大方格容积
1.4.2 酶活性测定 每次取鱼2尾采血，在4℃以3000r/min离心10min，制得血清备用。过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用Bruno Stellmach的紫外分光光度法[6]；碱性磷酸酶（AKP）活性的测定采用标准曲线法[6]。 2 结果与分析
2.1 五倍子对草鱼白细胞数量的影响 五倍子对草鱼白细胞数量的影响见表1。在试验后20d内白细胞数量呈递增的趋势，在第20d达到最大值，为4.55×104个/mm3，在第25d白细胞数目略有下降，为3.96×104个/mm3，但仍高于试验前数量。说明2.5mg/L浓度的五倍子对草鱼白细胞数量的增加有一定的促进作用。
2.3 五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性的影响 五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性的影响见表3。试验前，草鱼血清碱性磷酸酶活性为7.26金氏/100mL；在试验的前15d草鱼血清碱性磷酸酶活性逐渐高，并在第15d达到最大值，为8.37金氏/100mL；15d后，草鱼血清碱性磷酸酶活性有所降低，在第20d降为7.89金氏/100mL，在第25d降为7.65金氏/100mL，但整体而言，施药后草鱼血清碱性磷酸酶活性比施药前有所升高，由此说明，2.5mg/L浓度的五倍子能够一定程度地提高草鱼血清碱性磷酸酶活性。
3 讨论
（1）我国五倍子产量较大，分布很广，便于大规模开发生产，同时五倍子作为传统中药积累了大量的药物配方，五倍子在水产养殖中主要为外用药，施药方便。可以预见，随着五倍子各种活性物质的不断发现和作用机理的明晰，其在水产养殖上的应用前景将会越来越广阔，必将产生巨大的经济效益和社会效益[7]。
（2）白细胞是鱼类体内一种能吞噬异物、具有免疫和自我保护能力的物质，当鱼类生存的外界环境发生变化，为抵御外来毒害以及更好的适应环境，就会出现白细胞数目大量增多的现象[8]。本试验中草鱼白细胞数目随时间的变化有所增加，在0d～20d呈逐渐上升趋势，在20d数目达到最大值，在第25d有所下降，这说明2.5mg/L濃度的五倍子对草鱼白细胞数目的增加有一定的促进作用，从而提高鱼体免疫机能，达到预防疾病的效果。
（3）过氧化氢酶（CAT）能将细胞代谢所产生的H2O2迅速加以清除，从而保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白 [1]。本试验中CAT活性虽在第10d和第20d有不同程度的提高，总体来说，五倍子对草鱼血清CAT活性影响不明显。
（4）碱性磷酸酶（AKP）几乎存在于身体各种组织中，是膜结合酶，在肠上皮、肾小管、成骨细胞、肝脏及白细胞中尤其丰富。血清中AKP主要来源于肝和骨髓。AKP活性的测定对于机体免疫功能的探究和疾病的预防具有非常重要的意义[1]。本试验中，在第0d～第15d草鱼血清碱性磷酸酶活性有一定程度的提高，在第15d达到最大值，为8.37金氏/mL，在第20d和第25d有所下降。2.5mg/L浓度的五倍子对草鱼血清碱性磷酸酶活性有一定的促进作用。
参考文献
[1]李赫，宋文华，于翔.几种免疫增强剂对草鱼SOD、CAT 及 AKP活性的影响[J].水产学杂志，2010，23（4）：6-9.
[2]齐遵利，张秀文，韩叙.中草药对水产动物免疫促进作用的研究进展[J].安徽农业科学，2010，38（20）：10 734-10 736.
[3]姜蕾， 郑曙明.五倍子对鲤鱼细菌性败血症的药效试验初报[J].中国农学通报， 2006，22（5）：460-464.
[4]郑曙明，黄建军，吴青等.复方五倍子有效成分的分离鉴定及抑菌活性研究[J].水生生物学报， 2010，34（1）：57-64.
[5]姜蕾， 郑曙明.五倍子对3种致病菌的体外抑菌和急性毒性试验[J].水利渔业，2005，25（6）：89-90.
[6]Bruno Stellmach（钱嘉渊 译）酶的测定方法[M].北京：中国轻工业出版社，1992：168-194.
[7]李秀萍，李春远，渠桂荣等.五倍子的研究概况[J].中医药学报，2002，30（3）：72-74.
[8]田娟，冷向军，李小勤，等.复方中草药制剂对草鱼生长性能、肌肉成分和血清非特异性免疫的影响[J].安徽农业科学，2008，36（28）：12 282-12 284. （责编：张长青）