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摘要：为探索生肌调节因子（myogenic regulator factors，MRFs）家族基因在鲤鱼肌纤维形成中的基本作用，利用荧光定量PCR技术分别检测MRFs家族各成员在鲤鱼红肌、白肌中的表达差异，并与红肌纤维的标志基因MyHCⅠ及白肌纤维的标志基因MyHCⅡ的表达水平进行关联分析。结果表明，MyoD基因在鲤红肌中的表达极显著高于在白肌中的表达，并与MyHCⅠ基因的表达呈显著正相关，Myf6在鲤鱼白肌中的表达极显著高于其在红肌中的表达水平，并与MyHCⅡ基因的表达呈显著正相关，Myf5、MyoG在鲤鱼红肌、白肌中的表达水平差异不显著。
关键词：MRFs家族基因；红肌；背肌；腹肌；鲤
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0049-02
收稿日期：2014-11-26
基金项目：国家自然科学基金（编号：31201990）；四川省应用基础研究计划（编号：2014JY0088）；西南民族大学国家级大学生创新创业训练计划（编号：X201410656057）。
作者简介：张明（1988—），男，重庆人，从事生物技术研究。E-mail：zhangmingcoming@163.com。
通信作者：林亚秋，副教授，从事动物肉质调控研究。 E-mail：linyq1999@163.com。肌纤维类型及其组成对动物肉品质具有重要影响，肌纤维类型主要包括两大类：Ⅰ型（红肌、慢肌）、Ⅱ型（白肌、快肌）肌纤维。不同类型肌纤维特性不同（如收缩功能、线粒体成分、代谢特性等），进而导致肌肉品质存在差别[1-2]。研究表明，若肌肉中红肌纤维比例高于白肌纤维，则肌肉的品质较好[3-4]。Toniolo等将肌球蛋白重链 （myosin heavy chain，MyHC） 基因的同工型作为肌纤维类型的分子标志[5]。生肌调节因子（myogenic regulator factors，MRFs） 家族基因在动物肌纤维的形成、分化中具有重要的调控作用，该家族编码MyoD1、Myf5、MyoG、Myf6等4种肌肉特异性转录因子具有不同的时空表达特性[6-8]。本研究利用荧光定量PCR技术分析生肌调节因子家族MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6基因在鲤鱼红肌、白肌（背肌、腹肌）中的表达差异，并与红肌、白肌纤维标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的表达水平进行关联分析，初步确定该家族基因在鲤鱼肌纤维形成中的作用，旨在为通过肌纤维类型调控鱼类肉质提供依据。
1材料与方法
1.1样品的采集
所用鲤鱼购自西北农林科技大学安康水产试验示范站。选择体质量为500 g左右的成年鲤鱼6尾，致死后迅速取其背部红肌、背肌、腹肌组织，用锡箔纸包好，置于-80 ℃冰箱中备用。
1.2主要试剂
TRIzol总RNA提取试剂盒与SYBRPremix Ex TaqTM （2×）均购自大连TaKaRa公司；反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶均购自Fermentas公司；DEPC原液由Sigma公司分装。
1.3方法
1.3.1鲤鱼红肌、白肌组织总RNA提取与反转录取出备用的鲤鱼红肌、白肌组织，按照TRIzol试剂盒说明书的方法提取肌肉组织的RNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，同时利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。按照反转录试剂盒说明书的方法，取1 g总RNA，以Oligo （dT） 为引物反转录成cDNA第一链。
1.3.2引物的设计与合成根据GenBank上登陆的β-actin、MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ序列（表1），利用Primier 5.0软件设计这些基因的特异引物用来扩增在鲤鱼红肌、白肌中的表达差异。
1.3.3实时荧光定量PCR利用荧光定量PCR检测MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ基因在鲤红肌、白肌中的表达水平。总反应体系为20 μL，其中SYBRPremix Ex TaqTM （2×）PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57.6～62.3 ℃退火30 s，45个循环；72 ℃延伸30 s。
1.3.4数据分析采用SPSS 13.0软件分析数据，所得数据用“平均值±标准差”表示，采用ANOVA进行差异性显著检验分析。荧光定量结果采用2-ΔΔCT 方法进行分析[9]。
2结果与分析
2.1MyoD、Myf5、MyoG、Myf6基因在鲤鱼红肌、白肌中的表达差异
荧光定量检测MRFs家族基因在鲤鱼红肌、背肌、腹肌中的表达结果（图1至图4）显示，MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平极显著高于在背肌、腹肌中的表达水平。Myf6基因在鲤鱼背肌、腹肌中的表达水平极显著高于其在红肌中的表达水平。Myf5、MyoG基因在鲤鱼红肌与背肌、腹肌中的表达水平差异不显著。
2.2MRFs家族基因与肌纤维标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的相关性
MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平与MyHCⅠ基因的表1基因特异引物序列
基因名称特异引物序列退火温度表达呈极显著正相关（r=0.908，P<0.01），Myf6在鲤鱼白肌中的表达水平与MyHCⅡ基因的表达呈极显著正相关（r=1.000，P<0.01）。
3结论与讨论
MRFs家族基因都具有典型的碱性螺旋环结构，控制着动物肌肉发育的整个过程（包括成肌细胞的增殖、分化和肌纤维的形成），是动物肌肉发育过程中重要的正向调控因子。因此研究其在鱼类肌纤维形成中的作用具有重要意义。MRFs家族基因在哺乳动物、鱼类中的组织分布不同，在哺乳动物中仅在肌肉组织中表达[10-11]，在鱼类多种组织中均存在表达，但主要分布在肌肉组织中[12-14]。生肌调节因子在红肌、白肌中表达水平的差异对2种肌肉的肌纤维形成、肌肉生长率有影响。本研究结果表明，MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平极显著高于其在白肌（背肌、腹肌）中的表达水平，并与红肌纤维的标志基因呈显著正相关。Myf6基因在鲤鱼背肌、腹肌中的表达水平极显著高于其在红肌中的表达水平，并与白肌纤维的标志基因呈显著正相关。MyoG、Myf5基因在鲤鱼红肌中的表达水平与在背肌和腹肌中的表达水平差异不显著，可见MyoD可能在鲤鱼的红肌纤维形成中发挥主要作用，Myf6基因可能在鲤鱼的白肌纤维形成中发挥主要作用。MyoD在啮齿动物的白肌中表达量较高，Myogenin却表达量较低[15]，这与本试验结果不同，可能具有物种特异性。 参考文献：
[1]Berchtold M W，Brinkmeier H，Müntener M. Calcium ion in skeletal muscle：its crucial role for muscle function，plasticity，and disease[J]. Physiological Reviews，2000，80（3）：1215-1265.
[2]Picard B，Jurie C，Duris M P，et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livestock Science，2006，102（1/2）：107-120.
[3]Lefaucheur L，Milan D，Ecolan P，et al. Myosin heavy chain composition of different skeletal muscles in Large White and Meishan pigs[J]. Journal of Animal Science，2004，82（7）：1931-1941.
[4]Bowker B C，Botrel C，Swartz D R，et al. Influence of myosin heavy chain isoform expression and postmortem metabolism on the ATPase activity of muscle fibers[J]. Meat Science，2004，68（4）：587-594.
[5]Toniolo L，Maccatrozzo L，Patruno M，et al. Fiber types in canine muscles：myosin isoform expression and functional characterization[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology，2007，292（5）：C1915-C1926.
[6]Te Pas M F，Hulsegge I，Coster A，et al. Biochemical pathways analysis of microarray results：regulation of myogenesis in pigs[J]. BMC Developmental Biology，2007，7：66.
[7]Rescan P Y. Regulation and functions of myogenic regulatory factors in lower vertebrates[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2001，130（1）：1-12.
[8]Carvajal J J，Rigby P W. Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle[J]. Experimental Cell Research，2010，316（18）：3014-3018.
[9]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.
[10]王东林，毛宝龄. 生肌调节因子及其作用机理[J]. 国外医学：分子生物学分册，1995，17（4）：157-160.
[11]林亚秋，张倡珲，郑玉才，等. 九龙牦牛肌细胞生成素基因的克隆及其表达谱[J]. 畜牧兽医学报，2014，45（2）：207-211.
[12]Ye H Q，Chen S L，Xu J Y. Molecular cloning and characterization of the Myf5 gene in sea perch （Lateolabrax japonicus）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2007，147（3）：452-459.
[13]Johansen K A，Overturf K. Sequence，conservation，and quantitative expression of rainbow trout Myf5[J]. Comp Biochem Physiol：Part B，2005，140：533-541.
[14]林亚秋，李瑞文，郑玉才，等. 齐口裂腹鱼和鲤鱼H-FABP基因的克隆及其表达谱[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2011，27（6）：554-560.
[15]Ekmark M，Rana Z A，Stewart G，et al. De-phosphorylation of MyoD is linking nerve-evoked activity to fast myosin heavy chain expression in rodent adult skeletal muscle[J]. The Journal of Physiology，2007，584：637-650.郭志海，王鹏凯，郄红丽，等. 杨梅iPBS-PCR反应体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：51-54.
关键词：MRFs家族基因；红肌；背肌；腹肌；鲤
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0049-02
收稿日期：2014-11-26
基金项目：国家自然科学基金（编号：31201990）；四川省应用基础研究计划（编号：2014JY0088）；西南民族大学国家级大学生创新创业训练计划（编号：X201410656057）。
作者简介：张明（1988—），男，重庆人，从事生物技术研究。E-mail：zhangmingcoming@163.com。
通信作者：林亚秋，副教授，从事动物肉质调控研究。 E-mail：linyq1999@163.com。肌纤维类型及其组成对动物肉品质具有重要影响，肌纤维类型主要包括两大类：Ⅰ型（红肌、慢肌）、Ⅱ型（白肌、快肌）肌纤维。不同类型肌纤维特性不同（如收缩功能、线粒体成分、代谢特性等），进而导致肌肉品质存在差别[1-2]。研究表明，若肌肉中红肌纤维比例高于白肌纤维，则肌肉的品质较好[3-4]。Toniolo等将肌球蛋白重链 （myosin heavy chain，MyHC） 基因的同工型作为肌纤维类型的分子标志[5]。生肌调节因子（myogenic regulator factors，MRFs） 家族基因在动物肌纤维的形成、分化中具有重要的调控作用，该家族编码MyoD1、Myf5、MyoG、Myf6等4种肌肉特异性转录因子具有不同的时空表达特性[6-8]。本研究利用荧光定量PCR技术分析生肌调节因子家族MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6基因在鲤鱼红肌、白肌（背肌、腹肌）中的表达差异，并与红肌、白肌纤维标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的表达水平进行关联分析，初步确定该家族基因在鲤鱼肌纤维形成中的作用，旨在为通过肌纤维类型调控鱼类肉质提供依据。
1材料与方法
1.1样品的采集
所用鲤鱼购自西北农林科技大学安康水产试验示范站。选择体质量为500 g左右的成年鲤鱼6尾，致死后迅速取其背部红肌、背肌、腹肌组织，用锡箔纸包好，置于-80 ℃冰箱中备用。
1.2主要试剂
TRIzol总RNA提取试剂盒与SYBRPremix Ex TaqTM （2×）均购自大连TaKaRa公司；反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶均购自Fermentas公司；DEPC原液由Sigma公司分装。
1.3方法
1.3.1鲤鱼红肌、白肌组织总RNA提取与反转录取出备用的鲤鱼红肌、白肌组织，按照TRIzol试剂盒说明书的方法提取肌肉组织的RNA，经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，同时利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。按照反转录试剂盒说明书的方法，取1 g总RNA，以Oligo （dT） 为引物反转录成cDNA第一链。
1.3.2引物的设计与合成根据GenBank上登陆的β-actin、MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ序列（表1），利用Primier 5.0软件设计这些基因的特异引物用来扩增在鲤鱼红肌、白肌中的表达差异。
1.3.3实时荧光定量PCR利用荧光定量PCR检测MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ基因在鲤红肌、白肌中的表达水平。总反应体系为20 μL，其中SYBRPremix Ex TaqTM （2×）PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57.6～62.3 ℃退火30 s，45个循环；72 ℃延伸30 s。
1.3.4数据分析采用SPSS 13.0软件分析数据，所得数据用“平均值±标准差”表示，采用ANOVA进行差异性显著检验分析。荧光定量结果采用2-ΔΔCT 方法进行分析[9]。
2结果与分析
2.1MyoD、Myf5、MyoG、Myf6基因在鲤鱼红肌、白肌中的表达差异
荧光定量检测MRFs家族基因在鲤鱼红肌、背肌、腹肌中的表达结果（图1至图4）显示，MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平极显著高于在背肌、腹肌中的表达水平。Myf6基因在鲤鱼背肌、腹肌中的表达水平极显著高于其在红肌中的表达水平。Myf5、MyoG基因在鲤鱼红肌与背肌、腹肌中的表达水平差异不显著。
2.2MRFs家族基因与肌纤维标志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的相关性
MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平与MyHCⅠ基因的表1基因特异引物序列
基因名称特异引物序列退火温度表达呈极显著正相关（r=0.908，P<0.01），Myf6在鲤鱼白肌中的表达水平与MyHCⅡ基因的表达呈极显著正相关（r=1.000，P<0.01）。
3结论与讨论
MRFs家族基因都具有典型的碱性螺旋环结构，控制着动物肌肉发育的整个过程（包括成肌细胞的增殖、分化和肌纤维的形成），是动物肌肉发育过程中重要的正向调控因子。因此研究其在鱼类肌纤维形成中的作用具有重要意义。MRFs家族基因在哺乳动物、鱼类中的组织分布不同，在哺乳动物中仅在肌肉组织中表达[10-11]，在鱼类多种组织中均存在表达，但主要分布在肌肉组织中[12-14]。生肌调节因子在红肌、白肌中表达水平的差异对2种肌肉的肌纤维形成、肌肉生长率有影响。本研究结果表明，MyoD基因在鲤鱼红肌中的表达水平极显著高于其在白肌（背肌、腹肌）中的表达水平，并与红肌纤维的标志基因呈显著正相关。Myf6基因在鲤鱼背肌、腹肌中的表达水平极显著高于其在红肌中的表达水平，并与白肌纤维的标志基因呈显著正相关。MyoG、Myf5基因在鲤鱼红肌中的表达水平与在背肌和腹肌中的表达水平差异不显著，可见MyoD可能在鲤鱼的红肌纤维形成中发挥主要作用，Myf6基因可能在鲤鱼的白肌纤维形成中发挥主要作用。MyoD在啮齿动物的白肌中表达量较高，Myogenin却表达量较低[15]，这与本试验结果不同，可能具有物种特异性。 参考文献：
[1]Berchtold M W，Brinkmeier H，Müntener M. Calcium ion in skeletal muscle：its crucial role for muscle function，plasticity，and disease[J]. Physiological Reviews，2000，80（3）：1215-1265.
[2]Picard B，Jurie C，Duris M P，et al. Consequences of selection for higher growth rate on muscle fibre development in cattle[J]. Livestock Science，2006，102（1/2）：107-120.
[3]Lefaucheur L，Milan D，Ecolan P，et al. Myosin heavy chain composition of different skeletal muscles in Large White and Meishan pigs[J]. Journal of Animal Science，2004，82（7）：1931-1941.
[4]Bowker B C，Botrel C，Swartz D R，et al. Influence of myosin heavy chain isoform expression and postmortem metabolism on the ATPase activity of muscle fibers[J]. Meat Science，2004，68（4）：587-594.
[5]Toniolo L，Maccatrozzo L，Patruno M，et al. Fiber types in canine muscles：myosin isoform expression and functional characterization[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology，2007，292（5）：C1915-C1926.
[6]Te Pas M F，Hulsegge I，Coster A，et al. Biochemical pathways analysis of microarray results：regulation of myogenesis in pigs[J]. BMC Developmental Biology，2007，7：66.
[7]Rescan P Y. Regulation and functions of myogenic regulatory factors in lower vertebrates[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2001，130（1）：1-12.
[8]Carvajal J J，Rigby P W. Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle[J]. Experimental Cell Research，2010，316（18）：3014-3018.
[9]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.
[10]王东林，毛宝龄. 生肌调节因子及其作用机理[J]. 国外医学：分子生物学分册，1995，17（4）：157-160.
[11]林亚秋，张倡珲，郑玉才，等. 九龙牦牛肌细胞生成素基因的克隆及其表达谱[J]. 畜牧兽医学报，2014，45（2）：207-211.
[12]Ye H Q，Chen S L，Xu J Y. Molecular cloning and characterization of the Myf5 gene in sea perch （Lateolabrax japonicus）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2007，147（3）：452-459.
[13]Johansen K A，Overturf K. Sequence，conservation，and quantitative expression of rainbow trout Myf5[J]. Comp Biochem Physiol：Part B，2005，140：533-541.
[14]林亚秋，李瑞文，郑玉才，等. 齐口裂腹鱼和鲤鱼H-FABP基因的克隆及其表达谱[J]. 中国生物化学与分子生物学报，2011，27（6）：554-560.
[15]Ekmark M，Rana Z A，Stewart G，et al. De-phosphorylation of MyoD is linking nerve-evoked activity to fast myosin heavy chain expression in rodent adult skeletal muscle[J]. The Journal of Physiology，2007，584：637-650.郭志海，王鹏凯，郄红丽，等. 杨梅iPBS-PCR反应体系的建立与优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：51-54.