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[摘要]目的：利用代谢网络技术研究杜仲治疗大鼠皮肤光老化的作用机制和作用靶点。方法：采用经典的皮肤光老化动物模型制备方法，参考临床生化指标对所建立的模型进行评价，判定模型组大鼠皮肤老化程度，采用无歧视的代谢网络分析技术对大鼠的尿液样本进行全局分析，聚焦关键代谢通路和作用靶点。结果：形态学考察发现其具有典型的皮肤光老化特征。皮肤组织的各项指标均显示模型组大鼠机体发生的显著地氧化受损过程，给予杜仲后出现一定回调趋势。尿液代谢轨迹分析发现杜仲具有显著回调皮肤光老化的作用。进一步聚焦分析发现皮肤光老化大鼠的代谢主要集中在花生四烯酸代谢和谷胱甘肽代谢通路，谷胱甘肽过氧化酶可能是其潜在的作用靶点。结论：杜仲对由紫外光照射诱导的皮肤光老化大鼠模型具有很好的回调作用，谷胱甘肽代谢是其涉及的核心代谢通路，谷胱甘肽过氧化酶为其潜在的作用靶点。
[关键词]杜仲；紫外光；光老化；代谢组学；谷胱甘肽
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0070-03
杜仲（Codex Eucomnna）为杜仲科植物杜仲（Euconunia ulmides Oliv）干燥茎皮，杜仲在我国已有2000多年的药用历史。《神农本草经》将杜仲列为上品，杜仲是名贵滋补药材，具有补中益精气、强筋骨、强志、安胎、久服轻身耐老之功效。本研究依托药效学及代谢组学技术对皮肤光老化大鼠的代谢机制和杜仲干预皮肤光老化大鼠的作用机制进行研究，为杜仲防治皮肤光老化及延缓衰老作用研究提供实验依据。
1材料和方法
1.1仪器及试剂：AB SCIEX Triple QuadTM 3500（美国AB SCIEX公司）；XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多）；RT-9000半自动生化分析仪（美国雷杜公司）；紫外线照射仪（无锡四联公司）；紫外线辐照器（北京师范大学光电仪器厂）；VDUPL超纯水机（九方沃德科技有限公司）；羟脯氨酸（HYP）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（中生北控生物工程研究所、20160911、20160806和20160890）。杜仲购自贵州贵阳市，经黑龙江中医药大学陈孝忠副教授鉴定为杜仲科杜仲属杜仲的干燥树皮。
1.2动物及光老化动物模型制备：Sprague-Dawley（SD）大鼠雌雄各半，体重（150±10）g。黑龙江中医药大学实验动物中心提供，饲养于佳木斯大学动物实验中心，自由饮食饮水。剔除大鼠背部毛发，紫外光局部照射处理复制大鼠光老化模型。18只健康SD大鼠按体重随机分为3组，分别为空白组、模型组和给药组。大鼠麻醉取背部皮肤，置紫外光下30cm处，给予20min紫外线照射，OVA剂量为70J/cm2，隔日给予，共计3h。空白组背部剃毛处理、无紫外光照射处理。给药组灌胃给予800mg/kg杜仲提取液溶液，连续18d，模型组给予等量生理盐水。
1.3口服溶液制备：杜仲药材提取液溶于蒸馏水中制成0.1g/ml的灌胃溶液。
1.4生物样本的采集及制备：实验第19天早各组实验动物给予乌拉坦腹腔注射麻醉后，采集背部皮肤组织样本，面积约1cm×1cm背部皮肤组织，制备成皮肤组织匀浆液，分别取10μl、100μl和100μl，依据相应试剂盒使用说明方法用于皮肤组织T-SOD、N）A、HYP含量测定。模型制备过程中隔天早8点开始收集12h尿液，并离心（4℃、11000rpm/min、12min），取上清液置于-80℃环境下保存，尿液代谢样本采取原尿液与水1：4比例混溶，离心（4℃、11000rpm/min、12min），过0.22μm滤膜作为供试品溶液。
色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100mm×2.1mm i.d.，1.8μm）（Waters集团公司，美国）；流动相A0.1%的甲酸乙腈溶液，流动相B0.1%的甲酸水溶液；柱温35℃；流速0.4ml/min；进样量2μl；梯度洗脱方法见表1。
离子喷雾电压：6KV；离子源温度：500℃；碰撞能量（CE）：30eV；氮气为雾化气和辅助气：雾化气55psi，辅助气55 psi。质量范围为全扫描，积累时间250ms。工作站为Analyst TF 1.6软件。
1.5统计学分析：采用SPSS18.0数据处理软件对组间生化指标进行分析，T’TEST值小于0.05有统计学差异；代谢组学数据采用AB公司分析软件Peak View对进行数据预处理，在此基础上进行模式识别分析SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司），以正交偏最小二乘判别分析筛选尿液潜在生物标记物。
2结果
2.1生化指标检测结果：与空白组相比，模型组大鼠皮肤组织中的T-SOD活性明显降低，具有显著性差异（P<0.05），MDA含量显著升高，具有极显著性差异（P<0.01），光老化大鼠皮肤中羟脯氨酸HYP含量显著减少，具有极显著性差异（P<0.01），给予杜仲提取液后，呈回调趋势。见表2。
2.2尿液代谢组学研究结果：光老化多维数如图1所示，对上述数据进行模式识别分析以筛选潜在生物标记物。如图2所示，空白组和模型组两组分离明显，给药组代谢轮廓处于空白组和模型组间，且部分给药组与空白组重合，证明给药组的代谢整体向健康状态发展，杜仲对紫外照射的皮肤光老化有很好的治疗作用。进一步通过模式识别技术筛选出具有统计学差异的小分子代谢产物。同时结合数据库进行检索，共鉴定出皮肤光老化尿液潜核心生物标记物6个（图3～4），分别是氧化谷胱甘肽（Glutathione disulfide）、L-氨基酸（L-Amino acid）、双γ-谷氨酰胱氨（Bis-gamma-glutamylcystine）、甘氨酸（Glycine）、O-磷酸-L-氨酸（O-Phospho-L-serine）、L-氨酸（L-Serine），其中主要代谢物，如氧化谷胱甘肽的代谢网络示意图如图5所示。
3讨论
皮肤老化是影响生活质量和威胁人类健康的疾病之一，对其科学预防和治疗刻不容缓。目前市场上针对皮肤老化问题推出了一系列产品，其美容养颜功效只停留在表层，未能达到从机体代谢角度回调皮肤老化的目的。目前对皮肤老化的研究大多集中在细胞模型和动物模型的特定指标分析，未能从机体代谢的全局角度考虑皮肤老化的发病机制。故本实验采用系统生物学的代谢组学技术对皮肤老化大鼠的终端代谢产物进行全面分析，试图从代谢角度对其进行阐述。
前期研究表明，机体在长期或大剂量紫外光照射时会应激性的产生大量抗氧化酶，以对自身產生保护作用，同时也会大量消耗还原性代谢酶（如谷胱甘肽过氧化酶等）。损伤的皮肤抗氧化防御体系会产生更多的ROS，反作用于机体，加剧皮肤损伤的进程，最终导致皮肤组织细胞皱缩、老化，出现组织形态学改变。
随着系统生物学理论的完善和分析技术的快速发展，作为组学技术的最新分支代谢组学技术因其与中医药整体性理论的一致性，现已广泛应用于中医症候及中药方剂的机理研究中，采用经典的诊断指标对所建立的模型进行评价，确定所建立模型的可靠性，进而采用无损的尿液代谢组学技术对其机制进行研究，是目前中医药代谢组学研究的标准化流程。本研究基于前期实验和文献检索基础，采用代谢组学技术对模型组大鼠的尿液进行全面分析，通过代谢网络技术获取生物学信息。本次通过MS/MS技术和相关数据库分析共鉴定了由紫外光诱导的皮肤光老化潜在生物标记物6个，通过聚焦分析发现其置于参与谷胱甘肽代谢通路，这与之前的研究报道有很大的相关性，通过杜仲提取物的干预后有明显回调趋势，证明此代谢可能为其潜在的作用靶点，同时为其发病机制和杜仲治疗作用提供实验依据。
[关键词]杜仲；紫外光；光老化；代谢组学；谷胱甘肽
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）08-0070-03
杜仲（Codex Eucomnna）为杜仲科植物杜仲（Euconunia ulmides Oliv）干燥茎皮，杜仲在我国已有2000多年的药用历史。《神农本草经》将杜仲列为上品，杜仲是名贵滋补药材，具有补中益精气、强筋骨、强志、安胎、久服轻身耐老之功效。本研究依托药效学及代谢组学技术对皮肤光老化大鼠的代谢机制和杜仲干预皮肤光老化大鼠的作用机制进行研究，为杜仲防治皮肤光老化及延缓衰老作用研究提供实验依据。
1材料和方法
1.1仪器及试剂：AB SCIEX Triple QuadTM 3500（美国AB SCIEX公司）；XPE105分析天平（瑞士梅特勒托利多）；RT-9000半自动生化分析仪（美国雷杜公司）；紫外线照射仪（无锡四联公司）；紫外线辐照器（北京师范大学光电仪器厂）；VDUPL超纯水机（九方沃德科技有限公司）；羟脯氨酸（HYP）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（中生北控生物工程研究所、20160911、20160806和20160890）。杜仲购自贵州贵阳市，经黑龙江中医药大学陈孝忠副教授鉴定为杜仲科杜仲属杜仲的干燥树皮。
1.2动物及光老化动物模型制备：Sprague-Dawley（SD）大鼠雌雄各半，体重（150±10）g。黑龙江中医药大学实验动物中心提供，饲养于佳木斯大学动物实验中心，自由饮食饮水。剔除大鼠背部毛发，紫外光局部照射处理复制大鼠光老化模型。18只健康SD大鼠按体重随机分为3组，分别为空白组、模型组和给药组。大鼠麻醉取背部皮肤，置紫外光下30cm处，给予20min紫外线照射，OVA剂量为70J/cm2，隔日给予，共计3h。空白组背部剃毛处理、无紫外光照射处理。给药组灌胃给予800mg/kg杜仲提取液溶液，连续18d，模型组给予等量生理盐水。
1.3口服溶液制备：杜仲药材提取液溶于蒸馏水中制成0.1g/ml的灌胃溶液。
1.4生物样本的采集及制备：实验第19天早各组实验动物给予乌拉坦腹腔注射麻醉后，采集背部皮肤组织样本，面积约1cm×1cm背部皮肤组织，制备成皮肤组织匀浆液，分别取10μl、100μl和100μl，依据相应试剂盒使用说明方法用于皮肤组织T-SOD、N）A、HYP含量测定。模型制备过程中隔天早8点开始收集12h尿液，并离心（4℃、11000rpm/min、12min），取上清液置于-80℃环境下保存，尿液代谢样本采取原尿液与水1：4比例混溶，离心（4℃、11000rpm/min、12min），过0.22μm滤膜作为供试品溶液。
色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100mm×2.1mm i.d.，1.8μm）（Waters集团公司，美国）；流动相A0.1%的甲酸乙腈溶液，流动相B0.1%的甲酸水溶液；柱温35℃；流速0.4ml/min；进样量2μl；梯度洗脱方法见表1。
离子喷雾电压：6KV；离子源温度：500℃；碰撞能量（CE）：30eV；氮气为雾化气和辅助气：雾化气55psi，辅助气55 psi。质量范围为全扫描，积累时间250ms。工作站为Analyst TF 1.6软件。
1.5统计学分析：采用SPSS18.0数据处理软件对组间生化指标进行分析，T’TEST值小于0.05有统计学差异；代谢组学数据采用AB公司分析软件Peak View对进行数据预处理，在此基础上进行模式识别分析SIMCA 11.5（瑞典Umetrics公司），以正交偏最小二乘判别分析筛选尿液潜在生物标记物。
2结果
2.1生化指标检测结果：与空白组相比，模型组大鼠皮肤组织中的T-SOD活性明显降低，具有显著性差异（P<0.05），MDA含量显著升高，具有极显著性差异（P<0.01），光老化大鼠皮肤中羟脯氨酸HYP含量显著减少，具有极显著性差异（P<0.01），给予杜仲提取液后，呈回调趋势。见表2。
2.2尿液代谢组学研究结果：光老化多维数如图1所示，对上述数据进行模式识别分析以筛选潜在生物标记物。如图2所示，空白组和模型组两组分离明显，给药组代谢轮廓处于空白组和模型组间，且部分给药组与空白组重合，证明给药组的代谢整体向健康状态发展，杜仲对紫外照射的皮肤光老化有很好的治疗作用。进一步通过模式识别技术筛选出具有统计学差异的小分子代谢产物。同时结合数据库进行检索，共鉴定出皮肤光老化尿液潜核心生物标记物6个（图3～4），分别是氧化谷胱甘肽（Glutathione disulfide）、L-氨基酸（L-Amino acid）、双γ-谷氨酰胱氨（Bis-gamma-glutamylcystine）、甘氨酸（Glycine）、O-磷酸-L-氨酸（O-Phospho-L-serine）、L-氨酸（L-Serine），其中主要代谢物，如氧化谷胱甘肽的代谢网络示意图如图5所示。
3讨论
皮肤老化是影响生活质量和威胁人类健康的疾病之一，对其科学预防和治疗刻不容缓。目前市场上针对皮肤老化问题推出了一系列产品，其美容养颜功效只停留在表层，未能达到从机体代谢角度回调皮肤老化的目的。目前对皮肤老化的研究大多集中在细胞模型和动物模型的特定指标分析，未能从机体代谢的全局角度考虑皮肤老化的发病机制。故本实验采用系统生物学的代谢组学技术对皮肤老化大鼠的终端代谢产物进行全面分析，试图从代谢角度对其进行阐述。
前期研究表明，机体在长期或大剂量紫外光照射时会应激性的产生大量抗氧化酶，以对自身產生保护作用，同时也会大量消耗还原性代谢酶（如谷胱甘肽过氧化酶等）。损伤的皮肤抗氧化防御体系会产生更多的ROS，反作用于机体，加剧皮肤损伤的进程，最终导致皮肤组织细胞皱缩、老化，出现组织形态学改变。
随着系统生物学理论的完善和分析技术的快速发展，作为组学技术的最新分支代谢组学技术因其与中医药整体性理论的一致性，现已广泛应用于中医症候及中药方剂的机理研究中，采用经典的诊断指标对所建立的模型进行评价，确定所建立模型的可靠性，进而采用无损的尿液代谢组学技术对其机制进行研究，是目前中医药代谢组学研究的标准化流程。本研究基于前期实验和文献检索基础，采用代谢组学技术对模型组大鼠的尿液进行全面分析，通过代谢网络技术获取生物学信息。本次通过MS/MS技术和相关数据库分析共鉴定了由紫外光诱导的皮肤光老化潜在生物标记物6个，通过聚焦分析发现其置于参与谷胱甘肽代谢通路，这与之前的研究报道有很大的相关性，通过杜仲提取物的干预后有明显回调趋势，证明此代谢可能为其潜在的作用靶点，同时为其发病机制和杜仲治疗作用提供实验依据。