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摘要：目的 观察益气活血补肾方髓复康对大鼠脑缺血损伤区勿动蛋白（Nogo）-A及其受体（NgR）表达的抑制作用。方法 除正常组外，采用Koizumi法制作SD大鼠单侧大脑中动脉阻塞模型（MACO），并随机分为模型组、阳性对照组及髓复康大、中、小剂量组，各组在给药8、15、30 d 3个时间点取大鼠脑组织，采用免疫组化方法检测各组脑缺血损伤区Nogo-A及NgR表达量的差异。结果 髓复康大、中、小剂量组Nogo-A、NgR表达减弱，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 髓复康可抑制脑缺血损伤区Nogo-A、NgR表达，改善脑缺血损伤区轴突再生微环境，这可能是其促进脑缺血损伤后轴突再生的机制之一。
关键词：髓复康；脑缺血损伤；勿动蛋白；勿动蛋白受体；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0028-03
基金项目：国家自然科学基金（30701094）
通讯作者：郑格林，E-mail：zhenggelin@163.com
中枢神经系统（CNS）损伤后的再生修复一直是困扰医学界的难题。勿动蛋白（Nogo）-A是目前发现的最为强烈的神经纤维再生抑制物质，抑制损伤神经发生，尤其是再生神经纤维的
长距离生长[1-2]，Nogo受体（NgR）是一种糖基醇磷脂结合蛋白，是Nogo的一种功能性细胞表面受体，研究表明其在提高CNS再生能力的治疗方面有显著作用[3]。我们在前期实验研究中发现，不管是在在体实验还是在离体细胞培养中髓复康都可以促进损伤神经元轴突的再生[4]。本实验采用免疫组织化学染色的方法，从整体动物蛋白水平，观察髓复康对脑损伤大鼠神经元轴突再生抑制因子Nogo-A及NgR表达的影响，探讨髓复康促进损伤神经元轴突再生过程中Nogo-A及NgR的作用机制，为中药治疗脑缺血损伤修复提供一定的实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
成年雄性SD大鼠144只，体质量220～240 g，清洁级，购自维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2007-0001。
1.2 药物
髓复康，主要成分为黄芪、葛根、三七、川芎等，中国中医科学院望京医院药房制剂室制备煎剂，浓度为2.5 g/mL，置于4 ℃冰箱中备用。注射用甲基强地松龙，大连辉瑞制药有限公司，规格40 mg/支，批号040112。
1.3 试剂
乙醇、二甲苯，北京化学试剂公司，批号20100115、20100312；哈瑞氏苏木素染液，天合力恩试剂公司，批号20100106；Nogo-A一抗，英国abcam公司，批号667209；NgR一抗，英国abcam公司，批号820262。
1.4 仪器
EG1150H包埋机（德国LEICA公司），RM2235切片机（德国LEICA公司），HI1210摊片机（德国LEICA公司），BX51显微镜（日本OLYMPUS公司）。
2 实验方法
2.1 分组与造模
将144只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组及髓复康大、中、小剂量组，每组24只。各组根据给药时间不同，分为8、15、30 d 3个亚组，每个亚组8只大鼠。除正常组外，参照Koizumi法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型（MACO），从颈总动脉分叉处插入4-0丝线，沿颈内动脉进入距离颈总动脉分叉处约2.0 cm处停止，1 h后拔出丝线再灌注。
2.2 给药与取材
待动物清醒后，髓复康治疗组逐日灌胃髓复康煎剂，髓复康大、中、小剂量组灌胃原药材剂量分别为每次5、2.5、1.25 g/100 g；阳性对照组术后腹腔注射甲基强地松龙，剂量为每次30 mg/kg，隔日1次；模型组灌胃等量生理盐水；正常组同期喂养不做任何处置。各组每3 d称重1次，重新计算每只动物药量，直至取材时。各亚组在相应的取材时间点用0.4%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，4%多聚甲醛（pH值7.2～7.4）经心脏主动脉插管灌注处死动物。取全脑，制备病理切片。
2.3 大鼠脑缺血损伤区勿动蛋白-A及其受体表达检测
制备全脑病理切片后，进行前期脱腊处理：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→放入蒸馏水；PBS 5 min×3次；3%H2O2作用；进行抗原修复；加入一抗，37 ℃孵育作用2 h；PBS 5 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育作用1 h；PBS 5 min×3次；进行DAB显色；最后进行苏木素复染，封片。免疫组化染色后，通过图像分析软件MIA 4.0半定量分析Nogo-A和NgR的表达量。
3 统计学方法
采用SPSS11.0软件分析，所有数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白-A表达结果
Nogo-A在胞质中表达，阳性产物为棕黄色。研究结果表明，正常组大鼠脑组织中的Nogo-A 处于弱表达状态，且在各时间点没有明显的变化。模型组大鼠脑内的Nogo-A在各时间点的表达与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），损伤后15 d时表达最高，然后降低，至30 d时还处于高表达状态，明显高于正常组。各给药组大鼠脑损伤区的Nogo-A 表达趋势与模型组相同，但较模型组有不同程度的降低。阳性对照组与髓复康小剂量组Nogo-A的表达量组间差异不显著，但均与模型组形成差异；髓复康大剂量组和中剂量组比较差异不明显，但2组都明显低于模型组（P<0.01）。结果见表1。 4.2 大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白受体表达结果
NgR在胞质中表达，阳性产物为棕黄色。研究结果表明，正常组大鼠脑组织中的NgR 处于弱表达状态，且在各时间点没有明显变化。模型组大鼠脑内的NgR在各时间点的表达与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），损伤后8 d时表达最高，然后降低，至30 d时还处于高表达状态，明显高于正常组。各给药组大鼠脑损伤区的NgR 表达趋势与模型组相同，但较模型组各有不同程度的降低。髓复康小、中、大剂量组NgR的表达与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）；阳性对照组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。说明髓复康能有效抑制NgR的表达，从而减弱其神经再生的抑制作用。结果见表2。
5 讨论
Nogo抑制神经再生的调节机制研究是近几年研究的热点，它是一种能抑制中枢神经受损后再生的基因，包括Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，它们已经被证实对损伤后CNS的再生有抑制作用，即能够强烈抑制轴突的再生，但是现有的研究主要集中于Nogo-A[5-6]。成年哺乳动物CNS轴突不能再生部分原因是由于CNS髓磷脂的抑制特性，3种髓磷脂相关的蛋白分别为Nogo、MAG和OMgp，NgR是CNS中髓磷脂抑制轴突生长的主要受体，NgR分别与这3种抑制剂结合来调节它们的抑制信号；NgR是一种富含亮氨酸的脑特异性蛋白，与神经元的结合具有高亲和性和可饱和性，与Nogo-66具有高度亲和性，NgR广泛表达于包括大脑皮质神经元、小脑浦肯野细胞、海马神经元和脑桥神经元在内的CNS神经元细胞[7]。
Nogo的主要功能体现在Nogo-A及其受体NgR对中枢神经再生的抑制方面[8]。Nogo-A是目前发现的作用最为强烈的神经纤维再生抑制物质，是抑制轴突生长的化学屏障，可抑制损伤神经生长，尤其是再生神经纤维的长距离生长。有研究表明，脑梗死后各期Nogo-A及NgR均参与神经再生抑制，在脑梗死发生后较快的表达，在恢复期达到高峰，后逐渐降低，但在后遗症期还处于较高表达状态[5]。
脑缺血损伤的修复再生一直是神经科学领域内尚未解决但是又迫切需要解决的一道难题，成年哺乳动物CNS损伤后轴突不能有效再生，往往是不可逆性的功能丧失的主要原因。越来越多的研究表明，并不是中枢神经元自身的特性使其不能修复再生，若置于合适的微环境中，受损伤的神经元轴突是可以再生的[6]。中药可以诱导CNS产生有利的微环境，以促进神经再生。
髓复康由黄芪、葛根、三七、川芎等组成，功能主要为益气升阳、活血通络、补肾生髓。中医认为，脑缺血的主要病机是机体在各种病理因素作用下，阴阳失调，肝肾阴精受损，风、火、痰、气、血等病理产物瘀滞，在各种诱因作用下引发而致。其病机关键为肝肾阴虚、气滞血瘀，肝肾阴虚成于中风之先，是脑梗死发病的根本，已病之后贯穿于脑梗死的整个病理过程，且在其发展演变和治疗过程中往往进一步伤耗阴津，故宜采用滋补肝肾活血法治疗脑梗死。髓复康正是根据此法而设，活血化瘀且具有调补肝肾之效，补肾以填精生髓，补肝以养春生之木气，助肾生髓，肝肾并补，意在生髓以充脑。
本实验从蛋白水平研究髓复康解除轴突再生抑制因素的作用机制，观察到其在脑损伤各期均能够抑制损伤区Nogo-A和NgR蛋白表达，进而推测髓复康能够抑制轴突再生的化学屏障的形成，从而为受损伤的脑神经元提供合适的微环境，这可能是髓复康促进受损伤神经元轴突再生的机制之一。
参考文献：
[1] Oertle T， Marjan E. Nogo-A inhibits neurite outgrowth and cell spreading with three discrete regions[J]. Neuroscience，2003， 23（13）：5393-5406.
[2] Dodd DA， Niederoest B， B Ioechlinger S， et al. Nogo-A， -B and -C are found on the cell surface and interact together in many different cell types[J]. JBC，2005，10：1074.
[3] Li S， Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antagonist promotes recovery from spinal cord injury[J]. Neurosci，2003，23（10）：4219-4227.
[4] Huang YM， Zhao YQ， Tian W， et al. Experimental study on effect of Suifukang in promoting repairing and regeneration of nerve fibers in spinal cord[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2007，27（8）：724-727.
[5] Kim JE， Li S， GrandPre T， et al. Axon regeneration in young adult mice lacking Nogo-A/B[J]. Neuron，2003， 38（2）：187-199.
[6] Chen MS， Huber AB， van der Haar ME， et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody N-1[J]. Nature，2000，403：434-439.
[7] Foumier AE， GrandPré T， Strittmatter SM. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of axonal regeneration[J]. Nature，2001，409：341-346.
[8] McDonald CL， Steinbach K， Kern F， et al. Nogo receptor is involved in the adhesion of dendritic cells to myelin[J]. Neuroinflammtion，2011，8：113-124.
（收稿日期：2012-06-15，编辑：华强）
关键词：髓复康；脑缺血损伤；勿动蛋白；勿动蛋白受体；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0028-03
基金项目：国家自然科学基金（30701094）
通讯作者：郑格林，E-mail：zhenggelin@163.com
中枢神经系统（CNS）损伤后的再生修复一直是困扰医学界的难题。勿动蛋白（Nogo）-A是目前发现的最为强烈的神经纤维再生抑制物质，抑制损伤神经发生，尤其是再生神经纤维的
长距离生长[1-2]，Nogo受体（NgR）是一种糖基醇磷脂结合蛋白，是Nogo的一种功能性细胞表面受体，研究表明其在提高CNS再生能力的治疗方面有显著作用[3]。我们在前期实验研究中发现，不管是在在体实验还是在离体细胞培养中髓复康都可以促进损伤神经元轴突的再生[4]。本实验采用免疫组织化学染色的方法，从整体动物蛋白水平，观察髓复康对脑损伤大鼠神经元轴突再生抑制因子Nogo-A及NgR表达的影响，探讨髓复康促进损伤神经元轴突再生过程中Nogo-A及NgR的作用机制，为中药治疗脑缺血损伤修复提供一定的实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
成年雄性SD大鼠144只，体质量220～240 g，清洁级，购自维通利华实验动物中心，合格证号：SCXK（京）2007-0001。
1.2 药物
髓复康，主要成分为黄芪、葛根、三七、川芎等，中国中医科学院望京医院药房制剂室制备煎剂，浓度为2.5 g/mL，置于4 ℃冰箱中备用。注射用甲基强地松龙，大连辉瑞制药有限公司，规格40 mg/支，批号040112。
1.3 试剂
乙醇、二甲苯，北京化学试剂公司，批号20100115、20100312；哈瑞氏苏木素染液，天合力恩试剂公司，批号20100106；Nogo-A一抗，英国abcam公司，批号667209；NgR一抗，英国abcam公司，批号820262。
1.4 仪器
EG1150H包埋机（德国LEICA公司），RM2235切片机（德国LEICA公司），HI1210摊片机（德国LEICA公司），BX51显微镜（日本OLYMPUS公司）。
2 实验方法
2.1 分组与造模
将144只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组及髓复康大、中、小剂量组，每组24只。各组根据给药时间不同，分为8、15、30 d 3个亚组，每个亚组8只大鼠。除正常组外，参照Koizumi法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型（MACO），从颈总动脉分叉处插入4-0丝线，沿颈内动脉进入距离颈总动脉分叉处约2.0 cm处停止，1 h后拔出丝线再灌注。
2.2 给药与取材
待动物清醒后，髓复康治疗组逐日灌胃髓复康煎剂，髓复康大、中、小剂量组灌胃原药材剂量分别为每次5、2.5、1.25 g/100 g；阳性对照组术后腹腔注射甲基强地松龙，剂量为每次30 mg/kg，隔日1次；模型组灌胃等量生理盐水；正常组同期喂养不做任何处置。各组每3 d称重1次，重新计算每只动物药量，直至取材时。各亚组在相应的取材时间点用0.4%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，4%多聚甲醛（pH值7.2～7.4）经心脏主动脉插管灌注处死动物。取全脑，制备病理切片。
2.3 大鼠脑缺血损伤区勿动蛋白-A及其受体表达检测
制备全脑病理切片后，进行前期脱腊处理：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→放入蒸馏水；PBS 5 min×3次；3%H2O2作用；进行抗原修复；加入一抗，37 ℃孵育作用2 h；PBS 5 min×3次；加入二抗，37 ℃孵育作用1 h；PBS 5 min×3次；进行DAB显色；最后进行苏木素复染，封片。免疫组化染色后，通过图像分析软件MIA 4.0半定量分析Nogo-A和NgR的表达量。
3 统计学方法
采用SPSS11.0软件分析，所有数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白-A表达结果
Nogo-A在胞质中表达，阳性产物为棕黄色。研究结果表明，正常组大鼠脑组织中的Nogo-A 处于弱表达状态，且在各时间点没有明显的变化。模型组大鼠脑内的Nogo-A在各时间点的表达与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），损伤后15 d时表达最高，然后降低，至30 d时还处于高表达状态，明显高于正常组。各给药组大鼠脑损伤区的Nogo-A 表达趋势与模型组相同，但较模型组有不同程度的降低。阳性对照组与髓复康小剂量组Nogo-A的表达量组间差异不显著，但均与模型组形成差异；髓复康大剂量组和中剂量组比较差异不明显，但2组都明显低于模型组（P<0.01）。结果见表1。 4.2 大鼠脑缺血损伤区内勿动蛋白受体表达结果
NgR在胞质中表达，阳性产物为棕黄色。研究结果表明，正常组大鼠脑组织中的NgR 处于弱表达状态，且在各时间点没有明显变化。模型组大鼠脑内的NgR在各时间点的表达与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），损伤后8 d时表达最高，然后降低，至30 d时还处于高表达状态，明显高于正常组。各给药组大鼠脑损伤区的NgR 表达趋势与模型组相同，但较模型组各有不同程度的降低。髓复康小、中、大剂量组NgR的表达与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）；阳性对照组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。说明髓复康能有效抑制NgR的表达，从而减弱其神经再生的抑制作用。结果见表2。
5 讨论
Nogo抑制神经再生的调节机制研究是近几年研究的热点，它是一种能抑制中枢神经受损后再生的基因，包括Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，它们已经被证实对损伤后CNS的再生有抑制作用，即能够强烈抑制轴突的再生，但是现有的研究主要集中于Nogo-A[5-6]。成年哺乳动物CNS轴突不能再生部分原因是由于CNS髓磷脂的抑制特性，3种髓磷脂相关的蛋白分别为Nogo、MAG和OMgp，NgR是CNS中髓磷脂抑制轴突生长的主要受体，NgR分别与这3种抑制剂结合来调节它们的抑制信号；NgR是一种富含亮氨酸的脑特异性蛋白，与神经元的结合具有高亲和性和可饱和性，与Nogo-66具有高度亲和性，NgR广泛表达于包括大脑皮质神经元、小脑浦肯野细胞、海马神经元和脑桥神经元在内的CNS神经元细胞[7]。
Nogo的主要功能体现在Nogo-A及其受体NgR对中枢神经再生的抑制方面[8]。Nogo-A是目前发现的作用最为强烈的神经纤维再生抑制物质，是抑制轴突生长的化学屏障，可抑制损伤神经生长，尤其是再生神经纤维的长距离生长。有研究表明，脑梗死后各期Nogo-A及NgR均参与神经再生抑制，在脑梗死发生后较快的表达，在恢复期达到高峰，后逐渐降低，但在后遗症期还处于较高表达状态[5]。
脑缺血损伤的修复再生一直是神经科学领域内尚未解决但是又迫切需要解决的一道难题，成年哺乳动物CNS损伤后轴突不能有效再生，往往是不可逆性的功能丧失的主要原因。越来越多的研究表明，并不是中枢神经元自身的特性使其不能修复再生，若置于合适的微环境中，受损伤的神经元轴突是可以再生的[6]。中药可以诱导CNS产生有利的微环境，以促进神经再生。
髓复康由黄芪、葛根、三七、川芎等组成，功能主要为益气升阳、活血通络、补肾生髓。中医认为，脑缺血的主要病机是机体在各种病理因素作用下，阴阳失调，肝肾阴精受损，风、火、痰、气、血等病理产物瘀滞，在各种诱因作用下引发而致。其病机关键为肝肾阴虚、气滞血瘀，肝肾阴虚成于中风之先，是脑梗死发病的根本，已病之后贯穿于脑梗死的整个病理过程，且在其发展演变和治疗过程中往往进一步伤耗阴津，故宜采用滋补肝肾活血法治疗脑梗死。髓复康正是根据此法而设，活血化瘀且具有调补肝肾之效，补肾以填精生髓，补肝以养春生之木气，助肾生髓，肝肾并补，意在生髓以充脑。
本实验从蛋白水平研究髓复康解除轴突再生抑制因素的作用机制，观察到其在脑损伤各期均能够抑制损伤区Nogo-A和NgR蛋白表达，进而推测髓复康能够抑制轴突再生的化学屏障的形成，从而为受损伤的脑神经元提供合适的微环境，这可能是髓复康促进受损伤神经元轴突再生的机制之一。
参考文献：
[1] Oertle T， Marjan E. Nogo-A inhibits neurite outgrowth and cell spreading with three discrete regions[J]. Neuroscience，2003， 23（13）：5393-5406.
[2] Dodd DA， Niederoest B， B Ioechlinger S， et al. Nogo-A， -B and -C are found on the cell surface and interact together in many different cell types[J]. JBC，2005，10：1074.
[3] Li S， Strittmatter SM. Delayed systemic Nogo-66 receptor antagonist promotes recovery from spinal cord injury[J]. Neurosci，2003，23（10）：4219-4227.
[4] Huang YM， Zhao YQ， Tian W， et al. Experimental study on effect of Suifukang in promoting repairing and regeneration of nerve fibers in spinal cord[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2007，27（8）：724-727.
[5] Kim JE， Li S， GrandPre T， et al. Axon regeneration in young adult mice lacking Nogo-A/B[J]. Neuron，2003， 38（2）：187-199.
[6] Chen MS， Huber AB， van der Haar ME， et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody N-1[J]. Nature，2000，403：434-439.
[7] Foumier AE， GrandPré T， Strittmatter SM. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of axonal regeneration[J]. Nature，2001，409：341-346.
[8] McDonald CL， Steinbach K， Kern F， et al. Nogo receptor is involved in the adhesion of dendritic cells to myelin[J]. Neuroinflammtion，2011，8：113-124.
（收稿日期：2012-06-15，编辑：华强）