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摘要：为确保杀菌剂噻森铜在烟草上的安全使用，建立了一种高效液相色谱（HPLC-DAD）测定烟草中噻森铜残留量的分析方法。烟叶样品经硫代硫酸钠溶液衍生和提取，离心，三氯乙烯净化，乙酸乙酯萃取，高效液相色谱检测。结果表明，方法的平均回收率为79.55%～98.16%，相对标准偏差为0.94%～7.55%，噻森铜最低检出限为1.8 ng，噻森铜在烟叶样品中的最低检测限为0.5 mg/kg，符合农药残留分析的要求，适合烟草基质中噻森铜残留量的准确检测。
关键词：噻森铜；高效液相色谱；烟草
中图分类号： O657.7 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0284-03
收稿日期：2014-03-07
基金项目：贵州省重大科技专项（编号：20136024）；贵州省农业攻关项目（编号：20083053）。
作者简介：李智宁（1987—），男，河南开封人，硕士研究生，从事农药残留分析与环境毒理研究。E-mail：aning072@126.com。
通信作者：胡德禹，研究员，硕士生导师。Tel：（0851）8292170；E-mail：gzu_dyhu@126.com。噻森铜[N，N′-甲撑-双（2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑）铜]是我国自主创制的噻二唑类有机铜杀菌剂，是农业部全国农技中心重点推荐农药品种之一。其结构式见图1。其熔点300 ℃（分解），20 ℃时不溶于水，不溶于一般的有机溶剂，只微溶于吡啶、二甲基甲酰胺，遇强碱分解，在酸性条件下稳定。由于其结构由噻唑基与铜离子2 个基本基团组成，故有着特殊的作用机制 [1]。因此，噻森铜防治作物细菌性病害和真菌性病害具有高效广谱，低毒安全、环保无公害，不易产生抗性及持效期长等优点[2]
目前国内外对噻森铜的研究主要集中在田间药效[3-4]及杀菌活性[5]，对其残留分析的研究未见报道，为此查阅了一些与其结构相似的噻二唑类杀菌剂（噻菌铜/噻枯唑[6-11]）的残留分析方法，如采用硫化钠溶液水解，XAD-7树脂富集提取，柱层析纯化，液相色谱检测[6-7]；硫化钠溶液和甲醇提取，乙酸乙酯净化，液相色谱检测[8-9]；乙酸乙酯和二甲基甲酰胺混合液振荡提取，离心净化，液相色谱检测[11]。采用硫化钠衍生易产生对环境危害的副产物，且柱层析净化耗时较长，成本较高。鉴于此，建立新颖的，对环境友好的噻森铜残留检测方法十分必要。故本研究拟建立高效液相色谱法检测噻森铜在烟草中的残留，旨在为噻森铜在烟草上及其他农作物上安全使用提供参考。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1主要仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪（配DAD检测器）；涡旋混合仪（QL-901，其林贝尔仪器制造公司生产）；旋转蒸发仪（RE-2000/2000A，上海亚荣生化仪器厂生产）；氮吹仪（N-EVAPTM，上海安谱科学仪器有限公司生产）；水浴恒温振荡器（SHZ-A，上海博讯实业有限公司生产）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸易有限公司生产）。
1.1.2试剂甲醇（分析纯、色谱纯），乙腈（色谱纯），乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、冰乙酸、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、碳酸钾和硫化钠均为分析纯；超纯水，硅藻土Celite545，无水硫酸钠（450 ℃ 烘烤4 h，于干燥器中保存）；噻森铜标准品（纯度95.6%，浙江东风化工有限公司提供）；2-氨基-5-硫基-1，3，4-噻二唑（AMT）标准品（纯度98.0%，购于北京百灵威有限公司）。
1.2试验方法
1.2.1样品的提取和净化衍生和提取：称取10.0 g烟叶样品置于150 mL锥形瓶中，然后加入50 mL 0.5 mol/L硫代硫酸钠溶液，在60 ℃ 恒温水浴中，衍生反应振荡提取2 h，取出冷却至室温，准确量取40 mL提取液于50 mL离心管中，待净化。
净化：在上述离心管中加入6 g NaCl，以及2.0 mol/L NaOH使得溶液pH至12～13，待絮状物杂质析出，并于 6 000 r/min 离心5 min，将上清液转入125 mL分液漏斗中，再用40 mL含2%乙醇的三氯乙烯溶液预萃取1次，弃去下层有机相，上层用1.0 mol/L HCl调节pH至3～4，用50、40 mL 乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，过无水硫酸钠，浓缩至近干，N2吹干，甲醇定容至1 mL，过0.45 μm滤膜，待HPLC检测。
1.2.2色谱检测条件分别对色谱柱A：Eclipse XDB-C18，ZORBAX SB-C18，Phenomenex kinetex XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 和色谱柱B：Phenomenex C18/NH2，Lichrospher C18/CN/C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm ）进行筛选，同时改变流动相乙腈与0.1%乙酸水的体积比，确定最佳流动相。
2结果与分析
2.1色谱条件的选择
2.1.1检测波长的选择采用DAD检测器对噻森铜衍生化产物标准溶液（AMT，125 μg/mL）进行全波长扫描（扫描范围210～400 nm），从而得到AMT的吸收波长和响应值之间的紫外吸收光谱图（图2），可见AMT的最大吸收峰出现在312～314 nm处。因此，确定AMT的最佳检测波长是313 nm。
2.1.2色谱柱的选择由图3可知，色谱柱A色谱柱短，响应值较大，出峰时间早，分析时间快，但是烟草基质复杂，会有杂质影响。图4显示，色谱柱B（Phenomenex C18 色谱柱）响应值较大，出峰时间合适，峰形尖锐，对称性好，与杂质峰分离效果较好。故本研究最终选择 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ） 色谱柱。 2.1.3流动相的选择AMT分子巯基上的质子可以电离，并测得其电离常数Ka=1.8×10-7，其溶液呈微酸性[12-13]；在水中的溶解度较小，但随温度的增加而增加，AMT水溶液的pH=3.9，AMT乙醇溶液的pH=4.6[14]；故本研究选择乙腈与乙酸水溶液作为流动相的组成溶剂，使流动相呈现一定的酸性，在实验中多次改变乙腈与乙酸水溶液的比例，最终确定了流动相为乙腈-0.1%乙酸水（17.5 ∶82.5，体积比），此时获得的峰形较好。
2.2噻森铜标准曲线
用电子天平称取0.026 1 g 噻森铜标准品于100 mL容量瓶中配制为250 mg/L的标准样品溶液备用。将250 mg/L的噻森铜标准样品溶液用甲醇稀释配得1.0、2.5、5.0、10.0、
25.0、50.0 mg/L系列标准溶液，按照“1.2.2”节中样品前处理步骤进行噻森铜标样衍生化，每个浓度重复3次，以噻森铜标准溶液浓度（x）与色谱峰面积（y）作标准曲线，浓度在2.5～50 mg/L线性范围内，线性方程为：y=31.812 0x-35.122 0，相关系数（r）=0.999 8。
2.3方法的准确度与精密度
取空白烟叶样品，添加不同浓度噻森铜标样，每个浓度设5次重复，按照“1.2.2”节的测定步骤进行添加回收率试验，另设空白对照。测定结果见表1，结果表明噻森铜在烟叶样品添加水平为0.5～50.0 mg/kg时，回收率分别为75.92%～107.40%，RSD为0.94%～7.55%。试验结果均符合农药残留分析要求。表1噻森铜在烟叶中的添加回收率（n=5）
噻森铜添加水平
（mg/kg）添加回收率（%）ⅠⅡⅢⅣⅤ平均RSD
（%）0.575.9280.5088.0784.8587.6183.396.172.578.8880.4080.0078.6779.8479.550.945.099.3296.98107.4093.5993.5198.165.8250.085.32102.9089.1790.8387.8091.227.55
2.4最低检出限和最低检测限
在建立的色谱分析条件下，外标法定量，以3 倍信噪比（S/N=3）确定仪器的最低检出限，结果表明，本研究建立的检测方法，噻森铜的最低检出限为1.8 ng。噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg。烟叶空白样品（CK）、添加样品（TJ）和标准样品（BY）谱图如图5所示。
3结论
试验结果表明，采用高效液相色谱和紫外检测器建立的烟草中噻森铜残留分析方法，噻森铜最低检出限为1.8 ng，噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg，满足国家标准或行业标准的检测要求，同时该方法经济、安全，有机溶剂用量较小，操作简单，杂质干扰较少，准确度高，重现性好，能保证检测分析数据的可靠性。
参考文献：
[1]陈春雨. 农药新品种——噻森铜 二氰·锰锌[J]. 新农业，2011（7）：47-47.
[2]张纯标，梁帝允，王体祥，等. 新颖杀菌剂——噻森铜[J]. 世界农药，2007，29（2）：53-54.
[3]章瑶，王梅，张勇，等. 20%噻森铜悬浮剂对水稻细菌性病害的田间药效研究[J]. 现代农业科技，2006（19）：67.
[4]何荣林，邢家华，张纯标，等. 20%噻森铜悬浮剂防治水稻白叶枯病田间试验[J]. 现代农药，2007，6（2）：44-45.
[5]邢家华，何荣林. 噻森铜对水稻白叶枯病和细菌性条斑病室内杀菌活性[J]. 农药研究与应用，2007，11（4）：31-32.
[6]赵善仓，邓立刚，赵领军，等. 反相高效液相色谱法测定冬枣中噻菌铜的农药残留[J]. 农药，2007，46（8）：555-556.
[7]毛江胜，邓立刚，李增梅，等. 高效液相色谱法测定西瓜中残留的噻菌铜[J]. 分析测试学报，2007，26（5）：752-753.
[8]傅新文，陈红梅，张滨. 噻菌铜在土壤中消解动态研究[J]. 网络财富，2010（11）：192-193.
[9]胡秀卿，李振，郭钤，等. 烟草中噻菌铜残留量检测[J]. 浙江农业科学，2010（6）：1389-1390.
[10]蒙缔亚，任立伟，覃章兰. 高效液相色谱法测定20%增效噻枯唑可溶性粉剂中噻枯唑含量[J]. 分析科学学报，2001，17（2）：131-134.
[11]王志新，鹿泽启，徐维华，等. 叶枯唑在桃和土壤中的残留分析[J]. 安徽农业科学，2012，40（14）：8116-8117，8142.
[12]Domaglina L，Przyborowski. Uber die verwendbarkeit von 2-amino-1，3，4-thiadiazol-5-thiol in der analyse[J]. Zeitschriftfür Analytische Chemie，1965，207：411-414.
[13]Joshi S R，Gupta C B，Tandon S N. 2-Amino-5-mercapto-1，3，4-thiadiazole as an analytical reagent for the gravimetric determination and extraction of mercury（Ⅱ）[J]. Acta Chimica Academiae Scientiarum Hungaricae，1973，37：2429-2434.
[14]武海顺，许小红，马文瑾，等. AMT异构体互变机理的理论研究[J]. 物理化学学报，2003，19（5）：408-413.
关键词：噻森铜；高效液相色谱；烟草
中图分类号： O657.7 2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0284-03
收稿日期：2014-03-07
基金项目：贵州省重大科技专项（编号：20136024）；贵州省农业攻关项目（编号：20083053）。
作者简介：李智宁（1987—），男，河南开封人，硕士研究生，从事农药残留分析与环境毒理研究。E-mail：aning072@126.com。
通信作者：胡德禹，研究员，硕士生导师。Tel：（0851）8292170；E-mail：gzu_dyhu@126.com。噻森铜[N，N′-甲撑-双（2-氨基-5-巯基-1，3，4-噻二唑）铜]是我国自主创制的噻二唑类有机铜杀菌剂，是农业部全国农技中心重点推荐农药品种之一。其结构式见图1。其熔点300 ℃（分解），20 ℃时不溶于水，不溶于一般的有机溶剂，只微溶于吡啶、二甲基甲酰胺，遇强碱分解，在酸性条件下稳定。由于其结构由噻唑基与铜离子2 个基本基团组成，故有着特殊的作用机制 [1]。因此，噻森铜防治作物细菌性病害和真菌性病害具有高效广谱，低毒安全、环保无公害，不易产生抗性及持效期长等优点[2]
目前国内外对噻森铜的研究主要集中在田间药效[3-4]及杀菌活性[5]，对其残留分析的研究未见报道，为此查阅了一些与其结构相似的噻二唑类杀菌剂（噻菌铜/噻枯唑[6-11]）的残留分析方法，如采用硫化钠溶液水解，XAD-7树脂富集提取，柱层析纯化，液相色谱检测[6-7]；硫化钠溶液和甲醇提取，乙酸乙酯净化，液相色谱检测[8-9]；乙酸乙酯和二甲基甲酰胺混合液振荡提取，离心净化，液相色谱检测[11]。采用硫化钠衍生易产生对环境危害的副产物，且柱层析净化耗时较长，成本较高。鉴于此，建立新颖的，对环境友好的噻森铜残留检测方法十分必要。故本研究拟建立高效液相色谱法检测噻森铜在烟草中的残留，旨在为噻森铜在烟草上及其他农作物上安全使用提供参考。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1主要仪器Agilent 1100 高效液相色谱仪（配DAD检测器）；涡旋混合仪（QL-901，其林贝尔仪器制造公司生产）；旋转蒸发仪（RE-2000/2000A，上海亚荣生化仪器厂生产）；氮吹仪（N-EVAPTM，上海安谱科学仪器有限公司生产）；水浴恒温振荡器（SHZ-A，上海博讯实业有限公司生产）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸易有限公司生产）。
1.1.2试剂甲醇（分析纯、色谱纯），乙腈（色谱纯），乙酸乙酯、二甲基甲酰胺、冰乙酸、盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、碳酸钾和硫化钠均为分析纯；超纯水，硅藻土Celite545，无水硫酸钠（450 ℃ 烘烤4 h，于干燥器中保存）；噻森铜标准品（纯度95.6%，浙江东风化工有限公司提供）；2-氨基-5-硫基-1，3，4-噻二唑（AMT）标准品（纯度98.0%，购于北京百灵威有限公司）。
1.2试验方法
1.2.1样品的提取和净化衍生和提取：称取10.0 g烟叶样品置于150 mL锥形瓶中，然后加入50 mL 0.5 mol/L硫代硫酸钠溶液，在60 ℃ 恒温水浴中，衍生反应振荡提取2 h，取出冷却至室温，准确量取40 mL提取液于50 mL离心管中，待净化。
净化：在上述离心管中加入6 g NaCl，以及2.0 mol/L NaOH使得溶液pH至12～13，待絮状物杂质析出，并于 6 000 r/min 离心5 min，将上清液转入125 mL分液漏斗中，再用40 mL含2%乙醇的三氯乙烯溶液预萃取1次，弃去下层有机相，上层用1.0 mol/L HCl调节pH至3～4，用50、40 mL 乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，过无水硫酸钠，浓缩至近干，N2吹干，甲醇定容至1 mL，过0.45 μm滤膜，待HPLC检测。
1.2.2色谱检测条件分别对色谱柱A：Eclipse XDB-C18，ZORBAX SB-C18，Phenomenex kinetex XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm） 和色谱柱B：Phenomenex C18/NH2，Lichrospher C18/CN/C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm ）进行筛选，同时改变流动相乙腈与0.1%乙酸水的体积比，确定最佳流动相。
2结果与分析
2.1色谱条件的选择
2.1.1检测波长的选择采用DAD检测器对噻森铜衍生化产物标准溶液（AMT，125 μg/mL）进行全波长扫描（扫描范围210～400 nm），从而得到AMT的吸收波长和响应值之间的紫外吸收光谱图（图2），可见AMT的最大吸收峰出现在312～314 nm处。因此，确定AMT的最佳检测波长是313 nm。
2.1.2色谱柱的选择由图3可知，色谱柱A色谱柱短，响应值较大，出峰时间早，分析时间快，但是烟草基质复杂，会有杂质影响。图4显示，色谱柱B（Phenomenex C18 色谱柱）响应值较大，出峰时间合适，峰形尖锐，对称性好，与杂质峰分离效果较好。故本研究最终选择 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ） 色谱柱。 2.1.3流动相的选择AMT分子巯基上的质子可以电离，并测得其电离常数Ka=1.8×10-7，其溶液呈微酸性[12-13]；在水中的溶解度较小，但随温度的增加而增加，AMT水溶液的pH=3.9，AMT乙醇溶液的pH=4.6[14]；故本研究选择乙腈与乙酸水溶液作为流动相的组成溶剂，使流动相呈现一定的酸性，在实验中多次改变乙腈与乙酸水溶液的比例，最终确定了流动相为乙腈-0.1%乙酸水（17.5 ∶82.5，体积比），此时获得的峰形较好。
2.2噻森铜标准曲线
用电子天平称取0.026 1 g 噻森铜标准品于100 mL容量瓶中配制为250 mg/L的标准样品溶液备用。将250 mg/L的噻森铜标准样品溶液用甲醇稀释配得1.0、2.5、5.0、10.0、
25.0、50.0 mg/L系列标准溶液，按照“1.2.2”节中样品前处理步骤进行噻森铜标样衍生化，每个浓度重复3次，以噻森铜标准溶液浓度（x）与色谱峰面积（y）作标准曲线，浓度在2.5～50 mg/L线性范围内，线性方程为：y=31.812 0x-35.122 0，相关系数（r）=0.999 8。
2.3方法的准确度与精密度
取空白烟叶样品，添加不同浓度噻森铜标样，每个浓度设5次重复，按照“1.2.2”节的测定步骤进行添加回收率试验，另设空白对照。测定结果见表1，结果表明噻森铜在烟叶样品添加水平为0.5～50.0 mg/kg时，回收率分别为75.92%～107.40%，RSD为0.94%～7.55%。试验结果均符合农药残留分析要求。表1噻森铜在烟叶中的添加回收率（n=5）
噻森铜添加水平
（mg/kg）添加回收率（%）ⅠⅡⅢⅣⅤ平均RSD
（%）0.575.9280.5088.0784.8587.6183.396.172.578.8880.4080.0078.6779.8479.550.945.099.3296.98107.4093.5993.5198.165.8250.085.32102.9089.1790.8387.8091.227.55
2.4最低检出限和最低检测限
在建立的色谱分析条件下，外标法定量，以3 倍信噪比（S/N=3）确定仪器的最低检出限，结果表明，本研究建立的检测方法，噻森铜的最低检出限为1.8 ng。噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg。烟叶空白样品（CK）、添加样品（TJ）和标准样品（BY）谱图如图5所示。
3结论
试验结果表明，采用高效液相色谱和紫外检测器建立的烟草中噻森铜残留分析方法，噻森铜最低检出限为1.8 ng，噻森铜在烟草样品中的最低检测限为0.5 mg/kg，满足国家标准或行业标准的检测要求，同时该方法经济、安全，有机溶剂用量较小，操作简单，杂质干扰较少，准确度高，重现性好，能保证检测分析数据的可靠性。
参考文献：
[1]陈春雨. 农药新品种——噻森铜 二氰·锰锌[J]. 新农业，2011（7）：47-47.
[2]张纯标，梁帝允，王体祥，等. 新颖杀菌剂——噻森铜[J]. 世界农药，2007，29（2）：53-54.
[3]章瑶，王梅，张勇，等. 20%噻森铜悬浮剂对水稻细菌性病害的田间药效研究[J]. 现代农业科技，2006（19）：67.
[4]何荣林，邢家华，张纯标，等. 20%噻森铜悬浮剂防治水稻白叶枯病田间试验[J]. 现代农药，2007，6（2）：44-45.
[5]邢家华，何荣林. 噻森铜对水稻白叶枯病和细菌性条斑病室内杀菌活性[J]. 农药研究与应用，2007，11（4）：31-32.
[6]赵善仓，邓立刚，赵领军，等. 反相高效液相色谱法测定冬枣中噻菌铜的农药残留[J]. 农药，2007，46（8）：555-556.
[7]毛江胜，邓立刚，李增梅，等. 高效液相色谱法测定西瓜中残留的噻菌铜[J]. 分析测试学报，2007，26（5）：752-753.
[8]傅新文，陈红梅，张滨. 噻菌铜在土壤中消解动态研究[J]. 网络财富，2010（11）：192-193.
[9]胡秀卿，李振，郭钤，等. 烟草中噻菌铜残留量检测[J]. 浙江农业科学，2010（6）：1389-1390.
[10]蒙缔亚，任立伟，覃章兰. 高效液相色谱法测定20%增效噻枯唑可溶性粉剂中噻枯唑含量[J]. 分析科学学报，2001，17（2）：131-134.
[11]王志新，鹿泽启，徐维华，等. 叶枯唑在桃和土壤中的残留分析[J]. 安徽农业科学，2012，40（14）：8116-8117，8142.
[12]Domaglina L，Przyborowski. Uber die verwendbarkeit von 2-amino-1，3，4-thiadiazol-5-thiol in der analyse[J]. Zeitschriftfür Analytische Chemie，1965，207：411-414.
[13]Joshi S R，Gupta C B，Tandon S N. 2-Amino-5-mercapto-1，3，4-thiadiazole as an analytical reagent for the gravimetric determination and extraction of mercury（Ⅱ）[J]. Acta Chimica Academiae Scientiarum Hungaricae，1973，37：2429-2434.
[14]武海顺，许小红，马文瑾，等. AMT异构体互变机理的理论研究[J]. 物理化学学报，2003，19（5）：408-413.