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[摘要]目的探讨急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞(PBMCs)miR-145与超敏C反应蛋白的相关性。方法选取急性冠脉综合征患者90例,其中不稳定型心绞痛(UAP)30例(A组),ST段抬高型心肌梗死(STEMl)30例(B组)和非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMl)30例(C组)。另外30例以心前区不适住院,既往无高血压、糖尿病和冠心病史,经心电图、心肌酶学和冠状动脉造影排除冠心病者作为对照组(D组)。采用Rcal-time PCR法检测PBMCs中miR-145表达水平,使用U6作为内参对照。采用ELISA法检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。结果A组、B组、C组分别与D组比较,ACS患者外周血单核细胞miR-145表达水平明显降低,均有统计学意义(P<0.05);A组、B组、C组分别与D组比较,PBMCs培养基上清中细胞因子hs-CRP水平明显升高,均有统计学意义(P< 0.05);Pcarson相关分析结果显示,ACS患者外周血单核细胞miR-145表达与hs-CRP水平呈负相关性(r=-0.84,P<0.05)。结论ACS患者外周血单核细胞miR-145与超敏C反应蛋白之间呈负相关性,可能成为ACS新型标志物。
[关键词]急性冠脉综合征;外周血单核细胞miR-145;超敏C反应蛋白
中图分类号:l541.4 文献标识码:A 文章编号:1009-816X(2015)05-0359-03
急性冠脉综合征(Axute coronary svndrom,ACS)作为常见的心脏急症,是心血管疾病中致死致残的主要原因,包括不稳定心绞痛(Unstable Angina Pectoris,UAP)和急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI),而AMI包括非ST段抬高型心肌梗死(Non-ST-Elevation MvocaHlial Infarction,NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(ST-Elevation Myocardial Infarction,SIEMI)。文献报道,m1R-145在正常动脉血管和已分化的血管平滑肌(VSMCs)中表达最丰富,但在球囊损伤血管、ACS及去分化的VSMCs中表达很低。miR-145是VSMCs的表型调节器,通过对VSMCs的调节而成为ACS的保护因子,但在ACS中的表达情况目前尚不明确。本文对ACS患者血浆miR-145变化及其与hs-CRP的相关性进行探讨。
1.资料与方法
1.1.临床资料:选取2011年3月至2014年3月本院住院确诊为ACS患者90例,UAP、AMI诊断均按美国心脏病学会/美国心脏协会(2009年)标准,且均经冠状动脉造影证实。其中30例UAP(A组),60例AMI分为30例SIEMI(B组)和30例NSTEMI(C组)。另外30例以心前区不适住院,既往无高血压、糖尿病和冠心病史,经心电图、心肌酶学和冠状动脉造影排除冠心病者作为对照组(D组)。本研究经伦理委员会批准,所有患者均自愿加入并签署知情同意书。
1.2.方法:患者均在发病6h内从静脉采取空腹血3ml,肝素钠抗凝。PBMCs采用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心法进行分离:①置于EDTA—N0抗凝管,将新鲜血液转移至15ml离心管中,加入无菌的5mlPBS等倍稀释血液,上下颠倒混勾。②避光吸取5ml淋巴细胞分离液置于另一l5ml离心管,用吸管吸取稀释的血液,沿管壁小心缓慢加于淋巴细胞分离液上方,形成清晰界面。放入平衡离心机,室温下,2000转/min,离心30min。③离心后可以观察到管内液体分为三层,上层为淡黄色的血浆和PBS,下层主要是红细胞层,层为分离液层,上中层界面一层白色絮状物质即为单个核细胞层或白膜层。④用吸管小心吸取白膜层,置于另一l5ml离心管中,加入2~3倍体积的无菌PBS,上下颠倒混匀,2000转/min,离心10min。⑤倒掉上清,同法沉淀洗涤两次。⑥将⑤所得单个核细胞用900μL Trizol重悬,吸取置于无酶无菌1.5ml EP管中,暂时冻存于-80℃冰箱中以备提取RNA。
采用Real—time PCR法(ABI9700型PCR扩增仪由美国ABI公司:荧光定量PCR仪由德国Eppendorf公司:hsa-miR-145 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司:U6 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司提供)检测PBMCs中miR-145表达水平,使用U6作为内参对照。分离的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度2×106/ml,加入植物血凝素(PHA)5ng/ml浓度,置于37℃,5%C02培养箱培养48h后,收集上清液储存于-20℃用于hs-CRP检测。采用ELISA法(美国Beckman公司的IM-MAG全自动特种蛋白分析系统)检测hs-CRP水平,试剂盒由Beckman公司提供,严格按照试剂盒的说明操作。
2.结果
2.1.一般临床资料比较:A组、B组、C组分别与D组比较,在年龄、性别、体质指数(BMI)、舒张压(SBP)、收缩压(DBP)、空腹血糖(FPG)等构成上无统计学意义(P>0.05);A组、B组、C组分别与D组比较,ACS患者总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显降低,均有统计学意义(P<0.05)。
2.2.四组m1R-145相对表达水平:A组、B组、C组分别与D组比较,ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平明显降低,均有统计学意义(P<0.05)。且A组、B组、C组之间无统计学差异(P>0.05)。采用ELISA法检测hs-CRP水平,PBMCs培养基上清中细胞因子检测结果表明,A组、B组、C组分别与D组比较,PBMCs培乔基上清中细胞因子hs-CRP水平明显升高,均有统计学意义(P<0.05),且A组、B组、C组之间无统计学差异(P>0.05),见表1。 2.3.ACS患者外周血单核细胞miR-145与hs-CRP的相关性:Pearsom相关分析结果显示,ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平与hs-CRP水平呈负相关性(r=-0.84,P<0.05)。
3.讨论
ACS在我国发病率日益上升,是临床上常见的急危重症。ACS发生早期患者主要表现为胸痛症状,如果能在心肌尚未坏死的可逆阶段及时诊断并采取相应的治疗措施,可以大大降低死亡率和致残率。目前,肌钙蛋白(cTnT或cTnl)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)是诊断ACS特异性和敏感性较高的标志物,但在症状出现6h内灵敏度不高,而且难以检测微小型AMI,早期诊断能力受到限制,筛选新的心肌损伤标志物用于ACS诊断具有重要临床意义。
miRNA是一种单链非编码RNA,包含19-25个核苷酸,通过与靶基因mRNA的3,非编码区特异性结合,促进靶基因降解或抑制转录,进而调控靶基因的表达,在机体细胞的分化、增殖、凋亡等生理病理过程发挥重要作用。miRNA广泛存在于动植物体内,在人类血液、唾液、尿液等体液中均有分布,目前主要作为恶性肿瘤、肌肉损伤、炎症反应等情况的生物标志物。miR-145由23个核苷酸组成,定位于人类染色体Sq32上,在VSMCs高度表达,参与VSMCs收缩表型的维持与正常增殖而成为动脉粥样硬化的保护因子,但其在心血管事件中的变化情况目前尚未权威数据。
本研究中ACS患者miR145表达水平低于正常对照组,与Fichtlscherer的研究结果一致,Fichtlscherer认为miR-145主要作用是调节细胞骨架组件和PBMCs的迁移活性,参与血管内膜修复,因此ACS后miR-145的水平下降可能是斑块破裂和血管损伤的结果。而宋翠珠则发现急性期脑梗死患者血浆miR-145的表达水平升高,推测可能是脑梗死患者使用的阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物逆转了不稳定斑块炎症反应时相,miR-145上升或是动脉粥样硬化斑块破裂急性期炎症控制的间接表现。巨噬细胞浸润可引起斑块破裂部位出现明显的炎性反应,升高的hs-CRP正是反映了这些巨噬细胞的活性,本研究采血前未给予相应的临床治疗,miR-145降低和hs-CRP升高均表明机体处于不稳定斑块导致的炎症高峰期,但miR-145具体释放和影响机制目前尚不明确,而miR-145可能作为ACS生物标志物的假设,仍需要大量的基础和临床研究。
综上所述,ACS患者血浆miR-145表达明显下降,与炎症反应水平呈负相关,可能作为ACS的一个新型生物标志物。
[关键词]急性冠脉综合征;外周血单核细胞miR-145;超敏C反应蛋白
中图分类号:l541.4 文献标识码:A 文章编号:1009-816X(2015)05-0359-03
急性冠脉综合征(Axute coronary svndrom,ACS)作为常见的心脏急症,是心血管疾病中致死致残的主要原因,包括不稳定心绞痛(Unstable Angina Pectoris,UAP)和急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI),而AMI包括非ST段抬高型心肌梗死(Non-ST-Elevation MvocaHlial Infarction,NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(ST-Elevation Myocardial Infarction,SIEMI)。文献报道,m1R-145在正常动脉血管和已分化的血管平滑肌(VSMCs)中表达最丰富,但在球囊损伤血管、ACS及去分化的VSMCs中表达很低。miR-145是VSMCs的表型调节器,通过对VSMCs的调节而成为ACS的保护因子,但在ACS中的表达情况目前尚不明确。本文对ACS患者血浆miR-145变化及其与hs-CRP的相关性进行探讨。
1.资料与方法
1.1.临床资料:选取2011年3月至2014年3月本院住院确诊为ACS患者90例,UAP、AMI诊断均按美国心脏病学会/美国心脏协会(2009年)标准,且均经冠状动脉造影证实。其中30例UAP(A组),60例AMI分为30例SIEMI(B组)和30例NSTEMI(C组)。另外30例以心前区不适住院,既往无高血压、糖尿病和冠心病史,经心电图、心肌酶学和冠状动脉造影排除冠心病者作为对照组(D组)。本研究经伦理委员会批准,所有患者均自愿加入并签署知情同意书。
1.2.方法:患者均在发病6h内从静脉采取空腹血3ml,肝素钠抗凝。PBMCs采用人外周血淋巴细胞分离液密度梯度离心法进行分离:①置于EDTA—N0抗凝管,将新鲜血液转移至15ml离心管中,加入无菌的5mlPBS等倍稀释血液,上下颠倒混勾。②避光吸取5ml淋巴细胞分离液置于另一l5ml离心管,用吸管吸取稀释的血液,沿管壁小心缓慢加于淋巴细胞分离液上方,形成清晰界面。放入平衡离心机,室温下,2000转/min,离心30min。③离心后可以观察到管内液体分为三层,上层为淡黄色的血浆和PBS,下层主要是红细胞层,层为分离液层,上中层界面一层白色絮状物质即为单个核细胞层或白膜层。④用吸管小心吸取白膜层,置于另一l5ml离心管中,加入2~3倍体积的无菌PBS,上下颠倒混匀,2000转/min,离心10min。⑤倒掉上清,同法沉淀洗涤两次。⑥将⑤所得单个核细胞用900μL Trizol重悬,吸取置于无酶无菌1.5ml EP管中,暂时冻存于-80℃冰箱中以备提取RNA。
采用Real—time PCR法(ABI9700型PCR扩增仪由美国ABI公司:荧光定量PCR仪由德国Eppendorf公司:hsa-miR-145 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司:U6 real—time及RT—PCR引物由广州锐博生物科技有限公司提供)检测PBMCs中miR-145表达水平,使用U6作为内参对照。分离的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度2×106/ml,加入植物血凝素(PHA)5ng/ml浓度,置于37℃,5%C02培养箱培养48h后,收集上清液储存于-20℃用于hs-CRP检测。采用ELISA法(美国Beckman公司的IM-MAG全自动特种蛋白分析系统)检测hs-CRP水平,试剂盒由Beckman公司提供,严格按照试剂盒的说明操作。
2.结果
2.1.一般临床资料比较:A组、B组、C组分别与D组比较,在年龄、性别、体质指数(BMI)、舒张压(SBP)、收缩压(DBP)、空腹血糖(FPG)等构成上无统计学意义(P>0.05);A组、B组、C组分别与D组比较,ACS患者总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显降低,均有统计学意义(P<0.05)。
2.2.四组m1R-145相对表达水平:A组、B组、C组分别与D组比较,ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平明显降低,均有统计学意义(P<0.05)。且A组、B组、C组之间无统计学差异(P>0.05)。采用ELISA法检测hs-CRP水平,PBMCs培养基上清中细胞因子检测结果表明,A组、B组、C组分别与D组比较,PBMCs培乔基上清中细胞因子hs-CRP水平明显升高,均有统计学意义(P<0.05),且A组、B组、C组之间无统计学差异(P>0.05),见表1。 2.3.ACS患者外周血单核细胞miR-145与hs-CRP的相关性:Pearsom相关分析结果显示,ACS患者外周血单核细胞miR-145相对表达水平与hs-CRP水平呈负相关性(r=-0.84,P<0.05)。
3.讨论
ACS在我国发病率日益上升,是临床上常见的急危重症。ACS发生早期患者主要表现为胸痛症状,如果能在心肌尚未坏死的可逆阶段及时诊断并采取相应的治疗措施,可以大大降低死亡率和致残率。目前,肌钙蛋白(cTnT或cTnl)和肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)是诊断ACS特异性和敏感性较高的标志物,但在症状出现6h内灵敏度不高,而且难以检测微小型AMI,早期诊断能力受到限制,筛选新的心肌损伤标志物用于ACS诊断具有重要临床意义。
miRNA是一种单链非编码RNA,包含19-25个核苷酸,通过与靶基因mRNA的3,非编码区特异性结合,促进靶基因降解或抑制转录,进而调控靶基因的表达,在机体细胞的分化、增殖、凋亡等生理病理过程发挥重要作用。miRNA广泛存在于动植物体内,在人类血液、唾液、尿液等体液中均有分布,目前主要作为恶性肿瘤、肌肉损伤、炎症反应等情况的生物标志物。miR-145由23个核苷酸组成,定位于人类染色体Sq32上,在VSMCs高度表达,参与VSMCs收缩表型的维持与正常增殖而成为动脉粥样硬化的保护因子,但其在心血管事件中的变化情况目前尚未权威数据。
本研究中ACS患者miR145表达水平低于正常对照组,与Fichtlscherer的研究结果一致,Fichtlscherer认为miR-145主要作用是调节细胞骨架组件和PBMCs的迁移活性,参与血管内膜修复,因此ACS后miR-145的水平下降可能是斑块破裂和血管损伤的结果。而宋翠珠则发现急性期脑梗死患者血浆miR-145的表达水平升高,推测可能是脑梗死患者使用的阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物逆转了不稳定斑块炎症反应时相,miR-145上升或是动脉粥样硬化斑块破裂急性期炎症控制的间接表现。巨噬细胞浸润可引起斑块破裂部位出现明显的炎性反应,升高的hs-CRP正是反映了这些巨噬细胞的活性,本研究采血前未给予相应的临床治疗,miR-145降低和hs-CRP升高均表明机体处于不稳定斑块导致的炎症高峰期,但miR-145具体释放和影响机制目前尚不明确,而miR-145可能作为ACS生物标志物的假设,仍需要大量的基础和临床研究。
综上所述,ACS患者血浆miR-145表达明显下降,与炎症反应水平呈负相关,可能作为ACS的一个新型生物标志物。