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中圖分类号 R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）09-1252-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.24
摘 要 目的：研究无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、细胞周期和凋亡的影响，为明确其抗肿瘤作用机制提供参考。方法：采用MTT法考察低、中、高质量浓度的无梗五加果实乙醇提取物（0.92、1.84、3.68 mg/mL）、粗多糖提取物（0.06、0.12、0.24 mg/mL）和精多糖提取物（0.04、0.08、0.16 mg/mL）分别作用24、36、48 h后对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用；采用流式细胞术考察1.84 mg/mL乙醇提取物、0.24 mg/mL粗多糖提取物和0.16 mg/mL精多糖提取物分别作用24 h后对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和细胞凋亡的影响。以上试验均设阴性对照（只加细胞不加药物）。结果：与阴性对照比较，无梗五加果实3种提取物均可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖（P<0.01），显著降低G0/G1、G2/M期细胞的百分率（P<0.01），显著升高S期细胞的百分率（P<0.01），显著升高细胞凋亡率（P<0.05），其中以无梗五加果实乙醇提取物的作用最为明显。结论：无梗五加果实3种提取物均能抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，阻滞其细胞周期于S期，诱导其凋亡。
关键词 无梗五加果实；乙醇提取物；粗多糖提取物；精多糖提取物；人肝癌细胞SMMC-7721；增殖；凋亡
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of 3 extracts of Acanthopanax sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells SMMC-7721， and to provide reference for confirming the mechanism of anti-tumor effect. METHODS： MTT assay was adopted to investigate the effects of low-mass concentration， medium-mass concentration and high-mass concentration of ethanol extract （0.92， 1.84， 3.68 mg/mL）， crude polysaccharide extract （0.06， 0.12， 0.24 mg/mL） and refined polysaccharide extract （0.04， 0.08， 0.16 mg/mL） from A. sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells after treated for 24， 36， 48 h， respectively. Flow cytometry was used to investigate the effects of 1.84 mg/mL ethanol extract， 0.24 mg/mL crude polysaccharide extract and 0.16 mg/mL refined polysaccharide extract on cell cycle and cell apoptosis after treated for 24 h. The above tests were all negative control （only adding cells without drugs）. RESULTS： Compared with negative control， 3 extracts of A. sessiliflorus fruits could significantly inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells （P<0.01）， could significantly decrease the percentage of SMMC-7721 cells in G0/G1 and G2/M phase （P<0.01）， could significantly increase the percentage of SMMC-7721 cells in S phase （P<0.01） and the apoptosis rate of SMMC-7721 cells （P<0.05）； especially the effects of ethanol extract from A. sessiliflorus fruits were the most obvious. CONCLUSIONS： Three extracts of A. sessiliflorus fruits can inhibit the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells， block SMMC-7721 cells in S phase and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells.
KEYWORDS Acanthopanax sessiliflorus fruits； Ethanol extract； Crude polysaccharide extract； Refined polysaccharide extract； Human hepatocarcinoma cells SMMC-7721； Proliferation； Apoptosis 无梗五加[Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem]为五加科五加属一种重要的药用植物，主产于东北、河北、朝鲜等地[1]，其果实具有补肝肾、强筋骨的功效，主治肝肾亏虚、小儿行迟和筋骨痿软等症[2-3]，临床上主要用无梗五加制剂治疗白细胞减少症和脾肾阳虚型眩晕症[4]。另有报道称，无梗五加果实中多糖成分具有免疫调节、抗肿瘤的药理作用[5]。在本研究中，笔者拟采用MTT法考察无梗五加果实乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物在不同给药时间、不同浓度下对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用，确定最佳作用时间和最佳给药浓度。并在此基础上，进一步研究无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和凋亡的影响，从而明确其体外抑瘤作用机制。
1 材料
1.1 仪器
SUNRISE 酶标仪（瑞士Tecan公司）；FACE Vantage SE 流式细胞仪（美国BD公司）；AE31倒置相差显微镜（德国Motic公司）；冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；FA1004电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。
1.2 药材与试剂
无梗五加果实购自辽宁省丹东农业科学院，由辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem的干燥果实；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物技术有限公司，批号：KGA108）；MTT（美国Sigma公司）；胰蛋白酶、RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；其他试剂均为分析纯，细胞试验用水为三级纯化水。
1.3 细胞
人肝癌细胞株 SMMC-7721购自北京北纳创联生物技术研究院。
2 方法
2.1 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞增殖的影响
2.1.1 无梗五加果实3种提取物的制备 （1）乙醇提取物的制备。取无梗五加果实粗粉1 kg，石油醚回流提取3次，每次2 h，药渣晾干，加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥得无梗五加果实乙醇提取物178.2 g，得率为17.82%。（2）粗多糖的制备。取无梗五加果实粗粉1 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，滤过，滤液减压浓缩后，加入95%乙醇使含醇量达到50%，静置24 h，将沉淀冷冻干燥，得粗多糖提取物12.1 g，得率为1.21%。（3）精多糖的制備。取无梗五加果实粗粉1 kg，按照上述粗多糖的制备方法制备得到粗多糖，再将粗多糖提取物用水溶解制成一定浓度的溶液，采用Sevage法进行脱蛋白（Sevage试剂中氯仿和正丁醇的比例为3 ∶ 1，粗多糖溶液和Sevage试剂的比例为4 ∶ 1，混合振摇，以达到除去蛋白的目的）[6]，将除去蛋白的多糖溶液进行减压浓缩，冷冻干燥，得精多糖提取物8.0 g，得率为0.8%。
2.1.2 给药溶液的制备 根据各提取物收率的不同，按生药量均为5、10、20 mg/mL将3种提取物分别制备成不同质量浓度的药液：其中乙醇提取物给药浓度分别为0.92、1.84、3.68 mg/mL，粗多糖的给药浓度分别为0.06、0.12、0.24 mg/mL，精多糖的给药浓度分别为0.04、0.08、0.16 mg/mL，微孔滤膜过滤，备用。
2.1.3 细胞培养 按照常规贴壁细胞的培养方法将人肝癌细胞SMMC-7721接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在温度为37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行培养，隔天换液并传代1次，选取对数生长期的细胞用于研究。
2.1.4 MTT法检测 选取培养了2～3 d、处于对数生长期并且生长状态良好的人肝癌细胞SMMC-7721，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1～2次，再用0.25% 的胰酶进行消化传代，等到细胞状态趋于变圆的时候，使用培养液清洗，然后吹打细胞将其制成细胞悬液。采用细胞计数板进行细胞计数，用RPMI 1640培养液将细胞稀释至5×104 个/mL的密度，然后接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，将其置于CO2培养箱中继续进行培养12 h，待细胞贴壁完全后，进行试验分组。试验分为3种提取物的不同质量浓度的给药组（浓度设置见“2.1.2”项下）、阴性对照组（加细胞，但不加药液）和空白调零组（只加培养液，供酶标仪调零用） ，每组设立5个复孔，将细胞置于CO2培养箱中继续进行培养。在培养24、36、48 h后，分别在避光条件下每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT溶液，再次将细胞置于CO2培养箱中继续进行培养4 h，吸净孔内上清液，然后每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），等到紫色的结晶充分溶解后，使用酶标仪在492 nm波长处进行扫描[1]，测定光密度（OD）值，计算无梗五加果实各提取物对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率[6-8]：细胞增殖抑制率（%）=（1-给药组平均OD值/阴性对照组平均OD值）×100%。
2.2 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞周期和凋亡的影响
2.2.1 无梗五加果实3种提取物给药溶液的制备 根据前期MTT试验确定的各提取物抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖的最佳浓度，将无梗五加乙醇提取物、粗多糖、精多糖分别加水溶解制备成质量浓度分别为1.84、0.24、0.16 mg/mL的溶液，微孔滤膜过滤，备用。
2.2.2 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞周期的影响 取培养至对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，用0.25%的胰酶消化，用滴管吹打至单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于6 孔板中，每孔1 mL。将试验分为无梗五加果实乙醇提取物组（1.84 mg/mL）、粗多糖组（0.24 mg/mL）、精多糖组（0.16 mg/mL）和阴性对照组，将细胞置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养24 h后，给药组每孔分别给予无梗五加果实各提取物1 mL，阴性对照组每孔加入1 mL细胞培养液，每组设3个复孔。将培养板置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养48 h后，收集细胞，制备单细胞悬液，以802×g 离心5 min，用预冷的PBS洗涤细胞2次，然后以离心半径为5 cm、3 000 r/min 离心5 min，去上清，加入400 μL 的碘化丙啶（PI），混匀，4 ℃避光反应30 min，采用流式细胞仪检测488 nm波长处的红色荧光，ModFit细胞周期拟和软件进行分析。 2.2.3 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的影响 取培养至对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，按“2.2.2”项下方法进行消化、接種、给药、培养。培养48 h后，收集细胞及相应的细胞上清液，用PBS洗涤细胞2次，802×g离心5 min，去上清，加入荧光素FITC标记的膜联蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）5 μL，混匀，再加入PI染液5 μL，混匀，室温避光反应5～15 min，1 h内进行流式细胞仪检测，采用Cell Quest 软件分析细胞凋亡情况[9-14]。
2.3 统计学方法
采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析和t检验进行组间比较。 P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞增殖抑制率测定结果
无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞的增殖均有一定抑制作用。与阴性对照组比较，在给药24、48 h后各给药组细胞的OD值均显著降低（P<0.05或P<0.01），且乙醇提取物中浓度组和精多糖高浓度组细胞在培养36 h后的OD值显著降低（P<0.05）。比较各给药组细胞在给药24、36、48 h后结果可知，在给药48 h 后3种提取物对细胞增殖的抑制作用最强。粗多糖和精多糖的给药浓度越高，抑制作者用越强，存在一定的量效关系；而乙醇提取物对细胞的增殖抑制作用则不存在量效关系，中浓度给药时抑制作用最强，结果见表1。
3.2 细胞周期测定结果
与阴性对照组比较，乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组G0/G1、G2/M期细胞百分率显著降低（P<0.01），S期细胞百分率显著增加（P<0.01），其中乙醇提取物的作用效果优于粗多糖和精多糖。细胞周期检测的流式图见图1，测定结果见表2。
3.3 细胞凋亡率测定结果
与阴性对照组比较，乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组细胞的凋亡率均显著升高（P<0.05），其中以乙醇提取物组细胞凋亡率最高。阴性对照组、乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组细胞总凋亡率分别为5.6%、50.2%、17.9%、20.8%，细胞凋亡检测的流式图见图2。
4 讨论
本研究首先采用MTT法检测无梗五加果实乙醇提取物、粗多糖和精多糖的抗肿瘤活性，分别设立24、36和48 h这3个给药时间，每种提取物设立高、中、低3个给药浓度，通过对给药时间和给药浓度进行筛选，发现乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物均在48 h后药效最强。在给药剂量方面，发现粗多糖提取物和精多糖提取物都是在高浓度时药效最强，而乙醇提取物则是在中浓度时药效最强，故确定乙醇提取物、粗多糖和精多糖的最佳给药浓度分别是1.84、0.24、0.16 mg/mL。在采用MTT法明确了无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用后，进一步采用PI染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI双染色法分别观察无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和细胞凋亡的影响。研究发现，各提取物均可显著降低G0/G1和G2/M期细胞的百分率，显著升高S期细胞百分率，诱导细胞的凋亡。
试验中之所以对粗多糖和精多糖分别进行考察，是因为粗多糖与精多糖相比，主要区别是粗多糖含有一定量的蛋白质。分别考察粗多糖和精多糖抗肿瘤作用的目的，主要就是排除蛋白质的干扰，为后续实验进一步筛选抗肿瘤有效部位及单体奠定基础。
综合分析以上试验结果，可初步推测无梗五加果实3种提取物的抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡而产生的。
参考文献
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（收稿日期：2017-09-27 修回日期：2017-11-11）
（编辑：林 静）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.09.24
摘 要 目的：研究无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、细胞周期和凋亡的影响，为明确其抗肿瘤作用机制提供参考。方法：采用MTT法考察低、中、高质量浓度的无梗五加果实乙醇提取物（0.92、1.84、3.68 mg/mL）、粗多糖提取物（0.06、0.12、0.24 mg/mL）和精多糖提取物（0.04、0.08、0.16 mg/mL）分别作用24、36、48 h后对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用；采用流式细胞术考察1.84 mg/mL乙醇提取物、0.24 mg/mL粗多糖提取物和0.16 mg/mL精多糖提取物分别作用24 h后对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和细胞凋亡的影响。以上试验均设阴性对照（只加细胞不加药物）。结果：与阴性对照比较，无梗五加果实3种提取物均可显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖（P<0.01），显著降低G0/G1、G2/M期细胞的百分率（P<0.01），显著升高S期细胞的百分率（P<0.01），显著升高细胞凋亡率（P<0.05），其中以无梗五加果实乙醇提取物的作用最为明显。结论：无梗五加果实3种提取物均能抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，阻滞其细胞周期于S期，诱导其凋亡。
关键词 无梗五加果实；乙醇提取物；粗多糖提取物；精多糖提取物；人肝癌细胞SMMC-7721；增殖；凋亡
ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of 3 extracts of Acanthopanax sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of human hepatocarcinoma cells SMMC-7721， and to provide reference for confirming the mechanism of anti-tumor effect. METHODS： MTT assay was adopted to investigate the effects of low-mass concentration， medium-mass concentration and high-mass concentration of ethanol extract （0.92， 1.84， 3.68 mg/mL）， crude polysaccharide extract （0.06， 0.12， 0.24 mg/mL） and refined polysaccharide extract （0.04， 0.08， 0.16 mg/mL） from A. sessiliflorus fruits on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721 cells after treated for 24， 36， 48 h， respectively. Flow cytometry was used to investigate the effects of 1.84 mg/mL ethanol extract， 0.24 mg/mL crude polysaccharide extract and 0.16 mg/mL refined polysaccharide extract on cell cycle and cell apoptosis after treated for 24 h. The above tests were all negative control （only adding cells without drugs）. RESULTS： Compared with negative control， 3 extracts of A. sessiliflorus fruits could significantly inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells （P<0.01）， could significantly decrease the percentage of SMMC-7721 cells in G0/G1 and G2/M phase （P<0.01）， could significantly increase the percentage of SMMC-7721 cells in S phase （P<0.01） and the apoptosis rate of SMMC-7721 cells （P<0.05）； especially the effects of ethanol extract from A. sessiliflorus fruits were the most obvious. CONCLUSIONS： Three extracts of A. sessiliflorus fruits can inhibit the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells， block SMMC-7721 cells in S phase and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells.
KEYWORDS Acanthopanax sessiliflorus fruits； Ethanol extract； Crude polysaccharide extract； Refined polysaccharide extract； Human hepatocarcinoma cells SMMC-7721； Proliferation； Apoptosis 无梗五加[Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem]为五加科五加属一种重要的药用植物，主产于东北、河北、朝鲜等地[1]，其果实具有补肝肾、强筋骨的功效，主治肝肾亏虚、小儿行迟和筋骨痿软等症[2-3]，临床上主要用无梗五加制剂治疗白细胞减少症和脾肾阳虚型眩晕症[4]。另有报道称，无梗五加果实中多糖成分具有免疫调节、抗肿瘤的药理作用[5]。在本研究中，笔者拟采用MTT法考察无梗五加果实乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物在不同给药时间、不同浓度下对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用，确定最佳作用时间和最佳给药浓度。并在此基础上，进一步研究无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和凋亡的影响，从而明确其体外抑瘤作用机制。
1 材料
1.1 仪器
SUNRISE 酶标仪（瑞士Tecan公司）；FACE Vantage SE 流式细胞仪（美国BD公司）；AE31倒置相差显微镜（德国Motic公司）；冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；FA1004电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。
1.2 药材与试剂
无梗五加果实购自辽宁省丹东农业科学院，由辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.et Maxim.）Seem的干燥果实；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物技术有限公司，批号：KGA108）；MTT（美国Sigma公司）；胰蛋白酶、RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；其他试剂均为分析纯，细胞试验用水为三级纯化水。
1.3 细胞
人肝癌细胞株 SMMC-7721购自北京北纳创联生物技术研究院。
2 方法
2.1 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞增殖的影响
2.1.1 无梗五加果实3种提取物的制备 （1）乙醇提取物的制备。取无梗五加果实粗粉1 kg，石油醚回流提取3次，每次2 h，药渣晾干，加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，滤过，合并提取液，浓缩，干燥得无梗五加果实乙醇提取物178.2 g，得率为17.82%。（2）粗多糖的制备。取无梗五加果实粗粉1 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，滤过，滤液减压浓缩后，加入95%乙醇使含醇量达到50%，静置24 h，将沉淀冷冻干燥，得粗多糖提取物12.1 g，得率为1.21%。（3）精多糖的制備。取无梗五加果实粗粉1 kg，按照上述粗多糖的制备方法制备得到粗多糖，再将粗多糖提取物用水溶解制成一定浓度的溶液，采用Sevage法进行脱蛋白（Sevage试剂中氯仿和正丁醇的比例为3 ∶ 1，粗多糖溶液和Sevage试剂的比例为4 ∶ 1，混合振摇，以达到除去蛋白的目的）[6]，将除去蛋白的多糖溶液进行减压浓缩，冷冻干燥，得精多糖提取物8.0 g，得率为0.8%。
2.1.2 给药溶液的制备 根据各提取物收率的不同，按生药量均为5、10、20 mg/mL将3种提取物分别制备成不同质量浓度的药液：其中乙醇提取物给药浓度分别为0.92、1.84、3.68 mg/mL，粗多糖的给药浓度分别为0.06、0.12、0.24 mg/mL，精多糖的给药浓度分别为0.04、0.08、0.16 mg/mL，微孔滤膜过滤，备用。
2.1.3 细胞培养 按照常规贴壁细胞的培养方法将人肝癌细胞SMMC-7721接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在温度为37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行培养，隔天换液并传代1次，选取对数生长期的细胞用于研究。
2.1.4 MTT法检测 选取培养了2～3 d、处于对数生长期并且生长状态良好的人肝癌细胞SMMC-7721，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1～2次，再用0.25% 的胰酶进行消化传代，等到细胞状态趋于变圆的时候，使用培养液清洗，然后吹打细胞将其制成细胞悬液。采用细胞计数板进行细胞计数，用RPMI 1640培养液将细胞稀释至5×104 个/mL的密度，然后接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，将其置于CO2培养箱中继续进行培养12 h，待细胞贴壁完全后，进行试验分组。试验分为3种提取物的不同质量浓度的给药组（浓度设置见“2.1.2”项下）、阴性对照组（加细胞，但不加药液）和空白调零组（只加培养液，供酶标仪调零用） ，每组设立5个复孔，将细胞置于CO2培养箱中继续进行培养。在培养24、36、48 h后，分别在避光条件下每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT溶液，再次将细胞置于CO2培养箱中继续进行培养4 h，吸净孔内上清液，然后每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），等到紫色的结晶充分溶解后，使用酶标仪在492 nm波长处进行扫描[1]，测定光密度（OD）值，计算无梗五加果实各提取物对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率[6-8]：细胞增殖抑制率（%）=（1-给药组平均OD值/阴性对照组平均OD值）×100%。
2.2 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞周期和凋亡的影响
2.2.1 无梗五加果实3种提取物给药溶液的制备 根据前期MTT试验确定的各提取物抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖的最佳浓度，将无梗五加乙醇提取物、粗多糖、精多糖分别加水溶解制备成质量浓度分别为1.84、0.24、0.16 mg/mL的溶液，微孔滤膜过滤，备用。
2.2.2 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞周期的影响 取培养至对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，用0.25%的胰酶消化，用滴管吹打至单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于6 孔板中，每孔1 mL。将试验分为无梗五加果实乙醇提取物组（1.84 mg/mL）、粗多糖组（0.24 mg/mL）、精多糖组（0.16 mg/mL）和阴性对照组，将细胞置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养24 h后，给药组每孔分别给予无梗五加果实各提取物1 mL，阴性对照组每孔加入1 mL细胞培养液，每组设3个复孔。将培养板置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养48 h后，收集细胞，制备单细胞悬液，以802×g 离心5 min，用预冷的PBS洗涤细胞2次，然后以离心半径为5 cm、3 000 r/min 离心5 min，去上清，加入400 μL 的碘化丙啶（PI），混匀，4 ℃避光反应30 min，采用流式细胞仪检测488 nm波长处的红色荧光，ModFit细胞周期拟和软件进行分析。 2.2.3 无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡的影响 取培养至对数生长期的人肝癌细胞SMMC-7721，按“2.2.2”项下方法进行消化、接種、给药、培养。培养48 h后，收集细胞及相应的细胞上清液，用PBS洗涤细胞2次，802×g离心5 min，去上清，加入荧光素FITC标记的膜联蛋白Ⅴ（FITC-Annexin Ⅴ）5 μL，混匀，再加入PI染液5 μL，混匀，室温避光反应5～15 min，1 h内进行流式细胞仪检测，采用Cell Quest 软件分析细胞凋亡情况[9-14]。
2.3 统计学方法
采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析和t检验进行组间比较。 P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞增殖抑制率测定结果
无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC- 7721细胞的增殖均有一定抑制作用。与阴性对照组比较，在给药24、48 h后各给药组细胞的OD值均显著降低（P<0.05或P<0.01），且乙醇提取物中浓度组和精多糖高浓度组细胞在培养36 h后的OD值显著降低（P<0.05）。比较各给药组细胞在给药24、36、48 h后结果可知，在给药48 h 后3种提取物对细胞增殖的抑制作用最强。粗多糖和精多糖的给药浓度越高，抑制作者用越强，存在一定的量效关系；而乙醇提取物对细胞的增殖抑制作用则不存在量效关系，中浓度给药时抑制作用最强，结果见表1。
3.2 细胞周期测定结果
与阴性对照组比较，乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组G0/G1、G2/M期细胞百分率显著降低（P<0.01），S期细胞百分率显著增加（P<0.01），其中乙醇提取物的作用效果优于粗多糖和精多糖。细胞周期检测的流式图见图1，测定结果见表2。
3.3 细胞凋亡率测定结果
与阴性对照组比较，乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组细胞的凋亡率均显著升高（P<0.05），其中以乙醇提取物组细胞凋亡率最高。阴性对照组、乙醇提取物组、粗多糖组和精多糖组细胞总凋亡率分别为5.6%、50.2%、17.9%、20.8%，细胞凋亡检测的流式图见图2。
4 讨论
本研究首先采用MTT法检测无梗五加果实乙醇提取物、粗多糖和精多糖的抗肿瘤活性，分别设立24、36和48 h这3个给药时间，每种提取物设立高、中、低3个给药浓度，通过对给药时间和给药浓度进行筛选，发现乙醇提取物、粗多糖提取物和精多糖提取物均在48 h后药效最强。在给药剂量方面，发现粗多糖提取物和精多糖提取物都是在高浓度时药效最强，而乙醇提取物则是在中浓度时药效最强，故确定乙醇提取物、粗多糖和精多糖的最佳给药浓度分别是1.84、0.24、0.16 mg/mL。在采用MTT法明确了无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用后，进一步采用PI染色法和FITC-AnnexinⅤ/PI双染色法分别观察无梗五加果实3种提取物对人肝癌细胞SMMC-7721细胞周期和细胞凋亡的影响。研究发现，各提取物均可显著降低G0/G1和G2/M期细胞的百分率，显著升高S期细胞百分率，诱导细胞的凋亡。
试验中之所以对粗多糖和精多糖分别进行考察，是因为粗多糖与精多糖相比，主要区别是粗多糖含有一定量的蛋白质。分别考察粗多糖和精多糖抗肿瘤作用的目的，主要就是排除蛋白质的干扰，为后续实验进一步筛选抗肿瘤有效部位及单体奠定基础。
综合分析以上试验结果，可初步推测无梗五加果实3种提取物的抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤细胞的增殖和诱导细胞凋亡而产生的。
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（收稿日期：2017-09-27 修回日期：2017-11-11）
（编辑：林 静）