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[摘要] 目的 研究50例急性淋巴细胞白血病（ALL）流式免疫分型结果，探讨CD19、CD22、CD38、CyCD79a、CD7、CyCD3等白细胞分化抗原在急性淋巴细胞白血病临床免疫分型中的意义。 方法 对50例初诊确诊为急性淋巴细胞性白血病患者的骨髓细胞进行流式细胞术免疫分型检测，采用CD45及SSC双参数设门，胞浆抗原（CyCD79a、CyCD3）以细胞膜表面抗体表型≥20%判定为该抗体表达阳性，以细胞浆抗体表型≥10%判定为该抗体阳性表达。 结果 34例急性B淋巴性白血病中敏感性及特异性高的抗原分别为CD19（100.0%）和CyCD79a（100.0%）；16例急性T淋巴性白血病中敏感性及特异性高的抗原分别为CD7（100.0%）和CyCD3（100.0%）；CD10、CD34、HLA-DR、CD38等早期非特异性分化抗原标志在急性淋巴细胞性白血病表达频率均比较高。 结论 在ALL已经确诊的情况下，CD19和CyCD79a是确定B-ALL最重要的单克隆抗体，CyCD22是B淋巴细胞系列最具特异性单克隆抗体，但CyCD22的敏感性较低；CD7和CyCD3是确诊T淋巴细胞性白血病的最重要单克隆抗体。
[关键词] 免疫分型；流式细胞术；白血病；淋巴细胞；急性淋巴细胞性白血病
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）19-0113-03
[Abstract] Objective To explore the immunophenotypes of 50 cases with acute lymphoblastic leukemia（ALL） and to discuss the significances of leukocyte differentiation antigens including CD19， CD22， CD38， CyCD79a， CD7， and CyCD3 in the clinical immunophenotypes of ALL. Methods 50 patients with confirmed ALL at first visit were selected and immunophenotyping detection was conducted by flow cytometry to their bone marrow cells. Dual-parameters of CD45 and SSC were used for gating. Cytoplasmic antigens such as CyCD79a and CyCD3 were considered positive of antibody expression if cell membrane surface antibody phenotype≥20%， and the cytoplasmic autoantibodies were considered positive of antibody expression if the antibody phenotype≥10%. Results Antigens with high sensibility and specibility in 34 cases of B-ALL were CD19 （100.0%） and CyCD79a （100.0%）， while those in 16 cases of T-ALL were CD7（100.0%） and CyCD3 （100.0%）. Early non-specific differentiation antigen markers such as CD10， CD34， HLA-DR， and CD38 were of high expression frequencies in both types of ALL. Conclusion With confirmed ALL， CD19 and CD79a are important monoclonal antibodies in determination of B-ALL， while CyCD22 is the most specific monoclonal antibody in B lymphocytes， but its sensibility is low. CD7 and CyCD3 are the most important monoclonal antibodies in determination of T-ALL.
[Key words] Immunophenotype； Flow cytometry； Leukemia； Lymphocyte； Acute lymphocytic leukemia
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种淋巴系克隆性起源，多能干细胞或早期的祖细胞突变而引起的造血系统恶性肿瘤。它是由于血细胞中，主要是淋巴细胞异常肿瘤性增殖，并在体内各组织、器官，如骨髓、肝、脾、淋巴结等脏器广泛浸润，外周血中白细胞有质和量的异常，红细胞和血小板数减少，导致贫血、出血、感染和浸润等征象的一种疾病。近年来，随着流式细胞术的发展，通过流式细胞术来分析白血病细胞的来源以及分化阶段，从而为白血病的诊断、治疗及预后及复发风险的判断提供了重要的参考信息。流式细胞术具有灵敏度高，可重复性好，一次能检测信息量大等特性，能准确地反映白血病的起源和生物学特性。
白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，对骨髓和外周血中造血干细胞及其增殖分化、成熟过程中抗原的表达进行大量研究，多参数分析白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此检测白血病细胞所属细胞系列和及分化程度。免疫分型使白血病的诊断更加客观、准确、可靠，对白血病的治疗及预后分析具有重要意义。 本文对50例急性淋巴细胞白血病的流式免疫分型结果进行统计分析，研究急性淋巴细胞白血病的细胞免疫学特点，总结规律，为流式细胞术的临床免疫分型推广积累数据，现实验报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2016年1～4月再我院住院50例初诊患者均经骨髓涂片、形态学组织化学染色及临床表现确诊为ALL，分类按FAB诊断标准，所有病例的骨髓细胞化学过氧化物酶染色（POX）均阴性且糖原染色呈阳性。其中B淋巴细胞系列ALL（B-ALL）34例，T细胞系列ALL（T-ALL）16例；男28 例，女22例；年龄1.2～68岁，中位年龄24岁。
1.2 标本采集
行骨髓穿刺术留取骨髓2～3 mL，被检标本中的原始细胞及幼稚细胞应超过所有有核细胞的60%。
1.3 仪器设备
本实验所用流式细胞仪型号为COULTER EPICS，溶血剂FACS，破膜剂采用IitraPrep。荧光标记单抗髓系细胞相关的单抗如：CD13-PE、CD33-PE、CD14-PE、MPO-FITC；T系淋巴细胞相关的单抗如：CD3-FITC、CD5-FITC、CD7-FITC、CyCD3-PE；B系淋巴细胞相关的单抗如：CD19-FITC、CD22-FITC、Cy-CD79a-PE。非特异性泛表达的相关单抗如：CD34-PE、CD38-FITC、HLA-DR-FITC、CD10-PE、CD45-Cy-Chrome；同型细胞间对照单抗为IG1-FITC/IG1-PE/IG2a-FITC，上述所有荧光标记单抗都买自B-D试剂公司。
1.4 方法
用人淋巴细胞分离液分离肝素抗凝的骨髓液获得单个核细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）调整单个核细胞的浓度处于（1～5）×106/L范围内，再用荧光素标记的单克隆抗体标记上述骨髓单个核细胞后上机分析，其中FITC、PE、ECD、PC-5荧光分别设在PMT1、PMT2、PMT3、PMT4通道上，以CD45和SS双参数设门，每个测试管收取10 000个细胞，结果分析采用EXPO2软件。结果判断：胞浆抗原（CyCD79a、CyCD3）以阳性表达细胞数≥10%为阳性，其余胞膜分化抗原以阳性细胞数≥20%为阳性。
2 结果
2.1 急性淋巴细胞白血病系列相关性抗原表达情况
急性B淋巴细胞白血病的CD19检出率为100.0%，为急性B淋巴细胞白血病特异性抗原，CD22检出率为29.4%，且CD13、CD33泛髓系标志在急性B淋巴细胞白血病中也有表达（分别为26.5%、44.1%），可见CD13、CD33为非特异性抗原。急性T淋巴细胞白血病中CD3、和CD7检出率分别为62.5%、100.0%，是急性T淋巴细胞白血病的特异性抗原，且CD13和CD33也有表达。见表1。
2.2 急性淋巴细胞白血病胞浆内抗原表达情况
急性B淋巴细胞白血病的胞浆抗原CyCD79a检出率为100.0%，为急性B淋巴细胞白血病的特异性抗原，CyCD22检出率为23.5%，CyCD22检出率较CyCD79a低。急性T淋巴细胞白血病CyCD3检出率为100.0%，为急性T淋巴细胞白血病的胞浆特异性抗原，且MPO也有1例表达，提示MPO也可非特异性表达于急性T淋巴细胞白血病。见表2。
2.3 急性淋巴细胞白血病非特异性性抗原表达情况
非特异性抗原表达情况结果显示，CD10、HLA-DR、CD34、CD38在急性B淋巴细胞白血病中均有很高的检出率分别为（100.0%、100.0%、82.4%、82.4%）。在急性T淋巴细胞白血病中CD10仅有1例检出。HLA-DR、CD34、CD38在急性T淋巴细胞白血病中检出率分别为（50.0%、18.8%、100.0%）。见表3。
3 讨论
本研究结果表明，在已经明确ALL的情况下，CD19和胞浆CyCD79a 是确诊B淋巴细胞白血病的特异性单克隆抗体。目前的研究显示CD10并非B淋巴细胞系列特异性抗体，幼稚B淋巴细胞可以表达CD10，成熟粒细胞也可表达CD10[1，2]，且本实验中部分T-ALL中CD10也有表达。有研究资料显示[3]CyCD22在B淋巴细胞急淋诊断中非常重要，有很好的特异性，本实验也证实在T -ALL中CyCD22并没有阳性表达，但是CyCD22的敏感性低下，仅为29.4%。有研究报道认为CyCD79a无论是敏感性还是特异性均高于CyCD22。而且细胞膜表面的CD22也具有同样的特点[4-6]。CD22现在认为是评价急性淋巴细胞白血病分化阶段的标志之一，可作为急性淋巴白血病免疫分型中阶段划分的参考[7-9]。
本研究结果表明，确定T-ALL最重要的单抗有CD7和CyCD3。在B-ALL中两者均无假阳性，但是大量文献资料显示CD7可广泛表达于急性髓系白血病中，故CD7为T淋巴细胞性急淋的高敏感性抗体而非特异性抗体。CyCD3为T淋巴细胞性急淋的高特异性抗体[10]。有研究显示CyCD3只表达于胸腺发育的早期T淋巴细胞，不表达于骨髓或外周血淋巴细胞。因此有研究认为只要骨髓或外周血中同时表达CyCD3和TdT，就表明存在白血病细胞[11-13]。
目前被广泛接受的是CD13及CD33作为急性髓细胞白血病（AML）的系列相关抗体。本组病例中CD13及CD33在ALL中的表达率为3.9%～44.1%，较国外相关报道高，但是本实验中CD13和CD33和敏感性和特异性都不高，符合临床上部分急淋病例亦有低表达CD13和CD33的特点[14]。根据CD13及CD33的表达情况可初步AML方向，并进一步标记AML特异性抗体（如MPO）来达到AML免疫分型的目的[15]；现认为MPO是AML系列特异性胞浆内抗原，本组病例中MPO在B-ALL的阳性表达频率为0，而在T-ALL中的阳性表达频率为6.3%，这与本组T-ALL病例中有2例髓性标志阳性的T-ALL（My ALL）有关，其特异性是否比POX高需要更多的病例证实。CD34、HLA-DR、CD38作为造血细胞早期分化阶段的表面分化抗原，在本组病例实验中均有较高的表达频率。在我们的AML M4和M5的患者中检出的阳性率也很低（AML资料未给出），从而不能很好的区分ALL和AML。 [参考文献]
[1] Schafernak KT，Variakojis D，Goolsby CL，et al. Clonality assessment of cutaneous B-cell lymphoid proliferations：A comparison of flow cytometry immunophenotyping，molecular studies，and immunohistochemistry in situ hybridization and review of the literature[J]. American Journal of Dermatopathology，2014，36（10）：781-795.
[2] Subirá D，Simó M，Illán J，et al. Diagnostic and prognostic significance of flow cytometry immunophenotyping in patients with leptomeningeal carcinomatosis[J]. Clinical
[关键词] 免疫分型；流式细胞术；白血病；淋巴细胞；急性淋巴细胞性白血病
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）19-0113-03
[Abstract] Objective To explore the immunophenotypes of 50 cases with acute lymphoblastic leukemia（ALL） and to discuss the significances of leukocyte differentiation antigens including CD19， CD22， CD38， CyCD79a， CD7， and CyCD3 in the clinical immunophenotypes of ALL. Methods 50 patients with confirmed ALL at first visit were selected and immunophenotyping detection was conducted by flow cytometry to their bone marrow cells. Dual-parameters of CD45 and SSC were used for gating. Cytoplasmic antigens such as CyCD79a and CyCD3 were considered positive of antibody expression if cell membrane surface antibody phenotype≥20%， and the cytoplasmic autoantibodies were considered positive of antibody expression if the antibody phenotype≥10%. Results Antigens with high sensibility and specibility in 34 cases of B-ALL were CD19 （100.0%） and CyCD79a （100.0%）， while those in 16 cases of T-ALL were CD7（100.0%） and CyCD3 （100.0%）. Early non-specific differentiation antigen markers such as CD10， CD34， HLA-DR， and CD38 were of high expression frequencies in both types of ALL. Conclusion With confirmed ALL， CD19 and CD79a are important monoclonal antibodies in determination of B-ALL， while CyCD22 is the most specific monoclonal antibody in B lymphocytes， but its sensibility is low. CD7 and CyCD3 are the most important monoclonal antibodies in determination of T-ALL.
[Key words] Immunophenotype； Flow cytometry； Leukemia； Lymphocyte； Acute lymphocytic leukemia
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种淋巴系克隆性起源，多能干细胞或早期的祖细胞突变而引起的造血系统恶性肿瘤。它是由于血细胞中，主要是淋巴细胞异常肿瘤性增殖，并在体内各组织、器官，如骨髓、肝、脾、淋巴结等脏器广泛浸润，外周血中白细胞有质和量的异常，红细胞和血小板数减少，导致贫血、出血、感染和浸润等征象的一种疾病。近年来，随着流式细胞术的发展，通过流式细胞术来分析白血病细胞的来源以及分化阶段，从而为白血病的诊断、治疗及预后及复发风险的判断提供了重要的参考信息。流式细胞术具有灵敏度高，可重复性好，一次能检测信息量大等特性，能准确地反映白血病的起源和生物学特性。
白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作为分子探针，对骨髓和外周血中造血干细胞及其增殖分化、成熟过程中抗原的表达进行大量研究，多参数分析白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此检测白血病细胞所属细胞系列和及分化程度。免疫分型使白血病的诊断更加客观、准确、可靠，对白血病的治疗及预后分析具有重要意义。 本文对50例急性淋巴细胞白血病的流式免疫分型结果进行统计分析，研究急性淋巴细胞白血病的细胞免疫学特点，总结规律，为流式细胞术的临床免疫分型推广积累数据，现实验报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2016年1～4月再我院住院50例初诊患者均经骨髓涂片、形态学组织化学染色及临床表现确诊为ALL，分类按FAB诊断标准，所有病例的骨髓细胞化学过氧化物酶染色（POX）均阴性且糖原染色呈阳性。其中B淋巴细胞系列ALL（B-ALL）34例，T细胞系列ALL（T-ALL）16例；男28 例，女22例；年龄1.2～68岁，中位年龄24岁。
1.2 标本采集
行骨髓穿刺术留取骨髓2～3 mL，被检标本中的原始细胞及幼稚细胞应超过所有有核细胞的60%。
1.3 仪器设备
本实验所用流式细胞仪型号为COULTER EPICS，溶血剂FACS，破膜剂采用IitraPrep。荧光标记单抗髓系细胞相关的单抗如：CD13-PE、CD33-PE、CD14-PE、MPO-FITC；T系淋巴细胞相关的单抗如：CD3-FITC、CD5-FITC、CD7-FITC、CyCD3-PE；B系淋巴细胞相关的单抗如：CD19-FITC、CD22-FITC、Cy-CD79a-PE。非特异性泛表达的相关单抗如：CD34-PE、CD38-FITC、HLA-DR-FITC、CD10-PE、CD45-Cy-Chrome；同型细胞间对照单抗为IG1-FITC/IG1-PE/IG2a-FITC，上述所有荧光标记单抗都买自B-D试剂公司。
1.4 方法
用人淋巴细胞分离液分离肝素抗凝的骨髓液获得单个核细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）调整单个核细胞的浓度处于（1～5）×106/L范围内，再用荧光素标记的单克隆抗体标记上述骨髓单个核细胞后上机分析，其中FITC、PE、ECD、PC-5荧光分别设在PMT1、PMT2、PMT3、PMT4通道上，以CD45和SS双参数设门，每个测试管收取10 000个细胞，结果分析采用EXPO2软件。结果判断：胞浆抗原（CyCD79a、CyCD3）以阳性表达细胞数≥10%为阳性，其余胞膜分化抗原以阳性细胞数≥20%为阳性。
2 结果
2.1 急性淋巴细胞白血病系列相关性抗原表达情况
急性B淋巴细胞白血病的CD19检出率为100.0%，为急性B淋巴细胞白血病特异性抗原，CD22检出率为29.4%，且CD13、CD33泛髓系标志在急性B淋巴细胞白血病中也有表达（分别为26.5%、44.1%），可见CD13、CD33为非特异性抗原。急性T淋巴细胞白血病中CD3、和CD7检出率分别为62.5%、100.0%，是急性T淋巴细胞白血病的特异性抗原，且CD13和CD33也有表达。见表1。
2.2 急性淋巴细胞白血病胞浆内抗原表达情况
急性B淋巴细胞白血病的胞浆抗原CyCD79a检出率为100.0%，为急性B淋巴细胞白血病的特异性抗原，CyCD22检出率为23.5%，CyCD22检出率较CyCD79a低。急性T淋巴细胞白血病CyCD3检出率为100.0%，为急性T淋巴细胞白血病的胞浆特异性抗原，且MPO也有1例表达，提示MPO也可非特异性表达于急性T淋巴细胞白血病。见表2。
2.3 急性淋巴细胞白血病非特异性性抗原表达情况
非特异性抗原表达情况结果显示，CD10、HLA-DR、CD34、CD38在急性B淋巴细胞白血病中均有很高的检出率分别为（100.0%、100.0%、82.4%、82.4%）。在急性T淋巴细胞白血病中CD10仅有1例检出。HLA-DR、CD34、CD38在急性T淋巴细胞白血病中检出率分别为（50.0%、18.8%、100.0%）。见表3。
3 讨论
本研究结果表明，在已经明确ALL的情况下，CD19和胞浆CyCD79a 是确诊B淋巴细胞白血病的特异性单克隆抗体。目前的研究显示CD10并非B淋巴细胞系列特异性抗体，幼稚B淋巴细胞可以表达CD10，成熟粒细胞也可表达CD10[1，2]，且本实验中部分T-ALL中CD10也有表达。有研究资料显示[3]CyCD22在B淋巴细胞急淋诊断中非常重要，有很好的特异性，本实验也证实在T -ALL中CyCD22并没有阳性表达，但是CyCD22的敏感性低下，仅为29.4%。有研究报道认为CyCD79a无论是敏感性还是特异性均高于CyCD22。而且细胞膜表面的CD22也具有同样的特点[4-6]。CD22现在认为是评价急性淋巴细胞白血病分化阶段的标志之一，可作为急性淋巴白血病免疫分型中阶段划分的参考[7-9]。
本研究结果表明，确定T-ALL最重要的单抗有CD7和CyCD3。在B-ALL中两者均无假阳性，但是大量文献资料显示CD7可广泛表达于急性髓系白血病中，故CD7为T淋巴细胞性急淋的高敏感性抗体而非特异性抗体。CyCD3为T淋巴细胞性急淋的高特异性抗体[10]。有研究显示CyCD3只表达于胸腺发育的早期T淋巴细胞，不表达于骨髓或外周血淋巴细胞。因此有研究认为只要骨髓或外周血中同时表达CyCD3和TdT，就表明存在白血病细胞[11-13]。
目前被广泛接受的是CD13及CD33作为急性髓细胞白血病（AML）的系列相关抗体。本组病例中CD13及CD33在ALL中的表达率为3.9%～44.1%，较国外相关报道高，但是本实验中CD13和CD33和敏感性和特异性都不高，符合临床上部分急淋病例亦有低表达CD13和CD33的特点[14]。根据CD13及CD33的表达情况可初步AML方向，并进一步标记AML特异性抗体（如MPO）来达到AML免疫分型的目的[15]；现认为MPO是AML系列特异性胞浆内抗原，本组病例中MPO在B-ALL的阳性表达频率为0，而在T-ALL中的阳性表达频率为6.3%，这与本组T-ALL病例中有2例髓性标志阳性的T-ALL（My ALL）有关，其特异性是否比POX高需要更多的病例证实。CD34、HLA-DR、CD38作为造血细胞早期分化阶段的表面分化抗原，在本组病例实验中均有较高的表达频率。在我们的AML M4和M5的患者中检出的阳性率也很低（AML资料未给出），从而不能很好的区分ALL和AML。 [参考文献]
[1] Schafernak KT，Variakojis D，Goolsby CL，et al. Clonality assessment of cutaneous B-cell lymphoid proliferations：A comparison of flow cytometry immunophenotyping，molecular studies，and immunohistochemistry in situ hybridization and review of the literature[J]. American Journal of Dermatopathology，2014，36（10）：781-795.
[2] Subirá D，Simó M，Illán J，et al. Diagnostic and prognostic significance of flow cytometry immunophenotyping in patients with leptomeningeal carcinomatosis[J]. Clinical