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摘 要：瘦肉精是一类人工合成的β-肾上腺素激动剂，常被用作治疗支气管哮喘，因具有显著的合成代谢作用，往往被非法用作饲料添加剂。尤其是盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和氯丙那林等，能够增强肌肉质量，减少体脂。这类激动剂会在动物体内残留，从而通过动物对人体造成损害。本文就瘦肉精类药物常规监测方法中的预处理步骤和检测方法两方面，总结了其基本原理、操作过程、优缺点、研究进展等，并指出了目前存在的问题及在检测方面未来的发展方向。
关键词：瘦肉精;克伦特罗;莱克多巴胺;预处理;检测方式
瘦肉精又名盐酸克伦特罗，是一类人工合成的β-肾上腺素激动剂。它本是治疗支气管哮喘的药物，但由于其能够促进瘦肉生长，抑制肥肉生长，往往被不法养殖户用作饲料添加剂。传统的瘦肉精包括盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）、莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）等。该类药物的半衰期长，在体内代谢较慢，极易在动物体内蓄积，人食用后容易出现恶心、头晕、肌肉震颤、心悸等中毒病症，严重影响消费者的身体健康，近年来，许多国家如中国、俄罗斯、欧盟和日本，已经禁止在牲畜中使用瘦肉精，而在其他几个国家被允许使用，如美国、澳大利亚、加拿大、墨西哥和巴西。
目前瘦肉精主要的检测方法分为酶联免疫法、胶体金试纸法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法等。酶联免疫法是当前用来检测家畜饲料、尿液中的瘦肉精最为普遍、快速的方法。气相色谱-质谱联用法简单、灵敏、具有可重复性，但是常常需要复杂的步骤增加目标物的挥发性，分析物不稳定且分析耗时较长。液相色谱-质谱联用法具有专一性强、灵敏度高，但是仪器昂贵，检测人员专业性强，成本高，一般农贸市场很难普及。猪肉的基质较为复杂，在分析前需要对分析物进行额外的预处理净化除脂。常用的预处理方法有固相萃取技术、分散液相微萃取技术、液-液萃取技术、固相微萃取技术等。
1 预处理
1.1 固相萃取法
固相萃取技术是样品前处理技术中应用较为广泛的一种，用于样品的分离和净化，可大大提高检测的灵敏度。这种前处理技术相对于液-液萃取，能够避免由于受基质干扰而产生的乳化现象和萃取不完全导致的回收率较低问题，并且还能避免有机溶剂消耗，产生大量的废液，可自动化批量处理并且重现性好。但同时也存在一些缺点，前处理步骤烦琐，耗时长，使用进口固相萃取小柱成本较高且需要专业人员协助进行方法开发等。陈海玲[1]等用MCX固相萃取柱净化，测定了猪肝样品中的RAC，在0.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg添加的样品中，获得的平均回收率为82.0%～102.0%，相对标准偏差均<4%。此类研究运用固相萃取技术都取得了令人满意的检测效果。
1.2 液-液萃取
液-液萃取是最常用的液体样品萃取技术之一，它涉及到互不相溶的两相溶剂，利用待测物在两相中具有不同的亲疏性而达到分离的目的。在液-液萃取操作过程中一相通常为水相，而另一相为有机溶剂。亲水性强的化合物进入极性的水相多，而疏水化合物将主要溶于有机溶剂中。萃取进入有机相的被测物经溶剂挥发容易回收，而提取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相液相色谱柱中分析。但液-液萃取耗时长，需要使用大量的有机溶剂，尤其是高纯度的有机溶剂，这些试剂具强挥发性，且还具乳化现象，造成萃取剂和水体的分离困难。
1.3 分散液相微萃取
分散液相微萃取是2006年首次开发的一种快速、简单、方便、经济的预处理方法，已经应用于人体尿样中精神类药物和水体中多种农药残留的测定，但是在兽药残留方面的研究不多。该方法集采样、萃取和浓缩于一体，是一种操作简单、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理新技术。但该方法的明显缺陷是只能应用于样品基质相对简单的水样分析，在固体样品中不能直接使用。
1.4 固相微萃取法
固相微萃取的萃取方式有两种：一种是将石英纤维直接插入试样中进行萃取，适用于气体与液体中的组分分析;另一种是顶空萃取，适用于所有基质的试样中挥发性、半挥发性组分分析。该萃取方法具有操作方便、耗时短、不会对环境造成污染、仪器简单、易操作和灵敏度高等优点。但该方法价格昂贵、普适性不高，对目标化合物的回收率和精密度均低于液液萃取法。
2 检测方法
2.1 HPLC-MS检测
采用HPLC-MS检测肉样中的瘦肉精时，需要进行样品预处理。羊肉在分析前保持冷冻状态，切碎匀质后，取等分试样进行提取和净化。将醋酸缓冲溶液和β-葡萄糖苷酶添加到2.3 mL匀化的等分试样中，经过酶水解后，调节样品的酸碱度，离心，然后将SPE柱用甲醇和水进行活化，取上清液过柱，用2 mL水和2 mL乙酸盐缓冲溶液分别洗涤，并在真空下干燥。最后用甲醇进行最后一次洗涤，二氯甲烷和氨洗脱，洗出液蒸发至干，甲酸水溶液溶解，过滤膜后上机测定。张絜青[2]等采用该方法测定猪肉中的CLB，结果此方法检出限达到0.01 μg/kg，回收率为78.5%～98.6%。
2.2 HPLC检测
将精细均质的猪肉等分试样转移到50 mL锥形玻璃烧瓶中，加入乙酸钠和β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶并混合，以5 000 rpm离心10 min，取上清液转移到50 mL烧瓶中，用5 mL乙酸钠洗涤组织残余物，然后将高氯酸添加到上清液中，调节高氯酸的酸碱度。混合液再以5 000 r/min离心
10 min，将上清液转移到另一个50 mL离心管中，用NaOH将溶液调至强碱性（pH=11）。混合物用10 mL饱和氯化钠溶液和乙酸异丙醇乙酯的混合溶液完全萃取。将有机相转移到另一个离心管中，在温和的氮气流下干燥，用含有0.1%甲酸的甲醇/水定溶至1.0 mL，用于HPLC检测。HPLC涉及到多種检测器，常用的有紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器3种。 2.2.1 紫外检测器（HPLC-UV）
紫外吸收检测器（UV）是基于朗伯-比耳定律，根据被测组分对紫外光或可见光的吸收及吸收强度与组分浓度成正比的关系进行检测。具有应用广泛、灵敏度高、线性范围宽、对流动相的温度和流速变化不敏感及适合梯度洗脱等优点。但具有只能用于检测紫外吸收光的部分，溶剂要选无紫外光吸收的物质，紫外光不透过的溶剂不能检测。KUNPING[3]等人采用HPLC-UV法快速筛选猪肉样品中SAL、CLB和RAC，线性范围为0.2～50 μg/L，相关系数R2为0.99，相对标准偏差<3%，检出限<0.05 μg/L。
2.2.2 光电二极管阵列检测器（HPLC-DAD）
DAD是一种具有更高分析性能的检测器，由1 024个光电二极管阵列组成，每个光电二极管宽仅50 μm，各检测一窄段波长。在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过HPLC流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色器进行分光，最后得到各个组分的吸收信号，经计算机快速处理，得到三维立体谱图。金雁[4]等应用HPLC-DAD检测器同时测定CLB、SAL、OTC、TE，结果表明，CLB和SAL的线性范围为0.04～10 μg/mL，平均回收率为70.3%～94.3%，相对标准偏差为1.52%～5.85%;OTC和TE的线性范围为0.5～10 μg/mL，平均回收率为64.1%～94.2%，相对标准偏差为1.23%～4.53%。
2.3 GC-MS检测
与HPLC-UV相比，GC-MS检测更加快速、准确和灵敏，但其需要样品衍生化步骤，因为像CLB类的β-肾上腺素激动剂含有-OH、-NH2或-COOH等类似的极性基团，具沸点高、难挥发等特点，所以GC-MS检测多采用衍生化试剂用来改变样品的这些极性基团，使样品成为极性低、可气化的衍生分析物，然后通過对衍生物的定量实现检测母体瘦肉精的目标。图1为CLB分子结构，图2为CLB衍生化结构式。贾涛[5]应用GC-MS仪器测定猪饲料中的瘦肉精，添加回收率高达88.2%～98.2%，检出限低至0.50 μg/kg。
2.4 免疫分析法
免疫分析法根据抗原或抗体标记物质之间的差异，可以分为荧光免疫分析、酶联免疫法、胶体金免疫分析、化学发光免疫分析及放射免疫分析等。
3 展望
自“瘦肉精事件”后，国家对CLB类瘦肉精的监管力度有所增强，但市场上不断有新型的瘦肉精出现。虽然瘦肉精的预处理和检测技术日渐完善，但仍然存在一定缺陷，使用单一的检测技术不能解决问题，例如HPLC、GC等仪器对瘦肉精的检测虽然灵敏度高，并且假阳性低，使用该类仪器前处理过程比较烦琐且仪器昂贵，对于专业人员的要求也较高，不能满足原位快速检测的技术需求。ELISA克服了上述仪器检测方法的缺陷，但是该种方法检测出来的结果假阳性高，所以应将多种检测技术联合使用，取长补短，不断提高灵敏度，降低检出限。
目前国内外检测瘦肉精的手段技术还没有完全完善，并未建立准确、快速、方便的预处理和检测手段，在线检测瘦肉精就势在必行，瘦肉精的发展趋势可能包括以下两个方面。
（1）纳米材料是非常敏感的生物化学传感器，纳米生物传感器是固定选择性结合靶分子的生物探针的传感器，能够与免疫技术、生物芯片、标记技术等手段结合，快速、高效地检测猪肉中的瘦肉精残留。特异性纳米材料可用于瘦肉精化合物的吸附、提取，并与后续的固相萃取和固相微萃取相结合，同时也可应用于荧光分析和纳米酶等方面。今后随着纳米技术的不断深入发展，传感器将更加的微型化，检测时方便携带，自动化程度也会更高，方便在线检测。
（2）纳米金免疫标记技术是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面，金颗粒的特点是高电子密度，在金标蛋白结合处，可以在显微镜下看见黑褐色的颗粒物，当标记物在相应的配体处出现大量聚集的时候，通过肉眼观察到红色或粉红色斑点，可用于定性或半定量的检测。
相关的部门工作人员应根据不同方法的优缺点，发挥这些技术的长处，保障动物食品安全。随着科技的发展，可以相信未来一定会有更加方便、快速、经济、灵敏的检测方法，更加有效地检测瘦肉精的含量。
参考文献
[1]陈海玲，谢维平.猪肝样品中莱克多巴胺测定的前处理方法[J].分析科学学报，2016，32（3）：435-438.
[2]张絜青，陈煦，刘清.固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定猪肉中瘦肉精方法研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（9）：2182-2183.
[3]KUNPING Y，HUIQUN Z，WENLI H，et al.Rapid screening of toxic salbutamol，ractopamine，and clenbuterol in pork sample by high-performance liquid chromatography-UV method.Journal of Food and Drug Analysis，2016，24（2）：277-283.
[4]金雁，姚家彪，郭隽等.猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、OTC、TE残留量的HPLC同时测定方法研究[J].检验检疫科学，2008（5）：30-33.
[5]贾涛.气相色谱-串联质谱法测定饲料中的瘦肉精[J].饲料与畜牧，2013，6（7）：39-44.
关键词：瘦肉精;克伦特罗;莱克多巴胺;预处理;检测方式
瘦肉精又名盐酸克伦特罗，是一类人工合成的β-肾上腺素激动剂。它本是治疗支气管哮喘的药物，但由于其能够促进瘦肉生长，抑制肥肉生长，往往被不法养殖户用作饲料添加剂。传统的瘦肉精包括盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）、莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（Salbutamol，SAL）等。该类药物的半衰期长，在体内代谢较慢，极易在动物体内蓄积，人食用后容易出现恶心、头晕、肌肉震颤、心悸等中毒病症，严重影响消费者的身体健康，近年来，许多国家如中国、俄罗斯、欧盟和日本，已经禁止在牲畜中使用瘦肉精，而在其他几个国家被允许使用，如美国、澳大利亚、加拿大、墨西哥和巴西。
目前瘦肉精主要的检测方法分为酶联免疫法、胶体金试纸法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法等。酶联免疫法是当前用来检测家畜饲料、尿液中的瘦肉精最为普遍、快速的方法。气相色谱-质谱联用法简单、灵敏、具有可重复性，但是常常需要复杂的步骤增加目标物的挥发性，分析物不稳定且分析耗时较长。液相色谱-质谱联用法具有专一性强、灵敏度高，但是仪器昂贵，检测人员专业性强，成本高，一般农贸市场很难普及。猪肉的基质较为复杂，在分析前需要对分析物进行额外的预处理净化除脂。常用的预处理方法有固相萃取技术、分散液相微萃取技术、液-液萃取技术、固相微萃取技术等。
1 预处理
1.1 固相萃取法
固相萃取技术是样品前处理技术中应用较为广泛的一种，用于样品的分离和净化，可大大提高检测的灵敏度。这种前处理技术相对于液-液萃取，能够避免由于受基质干扰而产生的乳化现象和萃取不完全导致的回收率较低问题，并且还能避免有机溶剂消耗，产生大量的废液，可自动化批量处理并且重现性好。但同时也存在一些缺点，前处理步骤烦琐，耗时长，使用进口固相萃取小柱成本较高且需要专业人员协助进行方法开发等。陈海玲[1]等用MCX固相萃取柱净化，测定了猪肝样品中的RAC，在0.5 μg/kg、5.0 μg/kg、10.0 μg/kg添加的样品中，获得的平均回收率为82.0%～102.0%，相对标准偏差均<4%。此类研究运用固相萃取技术都取得了令人满意的检测效果。
1.2 液-液萃取
液-液萃取是最常用的液体样品萃取技术之一，它涉及到互不相溶的两相溶剂，利用待测物在两相中具有不同的亲疏性而达到分离的目的。在液-液萃取操作过程中一相通常为水相，而另一相为有机溶剂。亲水性强的化合物进入极性的水相多，而疏水化合物将主要溶于有机溶剂中。萃取进入有机相的被测物经溶剂挥发容易回收，而提取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相液相色谱柱中分析。但液-液萃取耗时长，需要使用大量的有机溶剂，尤其是高纯度的有机溶剂，这些试剂具强挥发性，且还具乳化现象，造成萃取剂和水体的分离困难。
1.3 分散液相微萃取
分散液相微萃取是2006年首次开发的一种快速、简单、方便、经济的预处理方法，已经应用于人体尿样中精神类药物和水体中多种农药残留的测定，但是在兽药残留方面的研究不多。该方法集采样、萃取和浓缩于一体，是一种操作简单、快速、成本低、富集效率高且对环境友好的样品前处理新技术。但该方法的明显缺陷是只能应用于样品基质相对简单的水样分析，在固体样品中不能直接使用。
1.4 固相微萃取法
固相微萃取的萃取方式有两种：一种是将石英纤维直接插入试样中进行萃取，适用于气体与液体中的组分分析;另一种是顶空萃取，适用于所有基质的试样中挥发性、半挥发性组分分析。该萃取方法具有操作方便、耗时短、不会对环境造成污染、仪器简单、易操作和灵敏度高等优点。但该方法价格昂贵、普适性不高，对目标化合物的回收率和精密度均低于液液萃取法。
2 检测方法
2.1 HPLC-MS检测
采用HPLC-MS检测肉样中的瘦肉精时，需要进行样品预处理。羊肉在分析前保持冷冻状态，切碎匀质后，取等分试样进行提取和净化。将醋酸缓冲溶液和β-葡萄糖苷酶添加到2.3 mL匀化的等分试样中，经过酶水解后，调节样品的酸碱度，离心，然后将SPE柱用甲醇和水进行活化，取上清液过柱，用2 mL水和2 mL乙酸盐缓冲溶液分别洗涤，并在真空下干燥。最后用甲醇进行最后一次洗涤，二氯甲烷和氨洗脱，洗出液蒸发至干，甲酸水溶液溶解，过滤膜后上机测定。张絜青[2]等采用该方法测定猪肉中的CLB，结果此方法检出限达到0.01 μg/kg，回收率为78.5%～98.6%。
2.2 HPLC检测
将精细均质的猪肉等分试样转移到50 mL锥形玻璃烧瓶中，加入乙酸钠和β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶并混合，以5 000 rpm离心10 min，取上清液转移到50 mL烧瓶中，用5 mL乙酸钠洗涤组织残余物，然后将高氯酸添加到上清液中，调节高氯酸的酸碱度。混合液再以5 000 r/min离心
10 min，将上清液转移到另一个50 mL离心管中，用NaOH将溶液调至强碱性（pH=11）。混合物用10 mL饱和氯化钠溶液和乙酸异丙醇乙酯的混合溶液完全萃取。将有机相转移到另一个离心管中，在温和的氮气流下干燥，用含有0.1%甲酸的甲醇/水定溶至1.0 mL，用于HPLC检测。HPLC涉及到多種检测器，常用的有紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器3种。 2.2.1 紫外检测器（HPLC-UV）
紫外吸收检测器（UV）是基于朗伯-比耳定律，根据被测组分对紫外光或可见光的吸收及吸收强度与组分浓度成正比的关系进行检测。具有应用广泛、灵敏度高、线性范围宽、对流动相的温度和流速变化不敏感及适合梯度洗脱等优点。但具有只能用于检测紫外吸收光的部分，溶剂要选无紫外光吸收的物质，紫外光不透过的溶剂不能检测。KUNPING[3]等人采用HPLC-UV法快速筛选猪肉样品中SAL、CLB和RAC，线性范围为0.2～50 μg/L，相关系数R2为0.99，相对标准偏差<3%，检出限<0.05 μg/L。
2.2.2 光电二极管阵列检测器（HPLC-DAD）
DAD是一种具有更高分析性能的检测器，由1 024个光电二极管阵列组成，每个光电二极管宽仅50 μm，各检测一窄段波长。在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过HPLC流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色器进行分光，最后得到各个组分的吸收信号，经计算机快速处理，得到三维立体谱图。金雁[4]等应用HPLC-DAD检测器同时测定CLB、SAL、OTC、TE，结果表明，CLB和SAL的线性范围为0.04～10 μg/mL，平均回收率为70.3%～94.3%，相对标准偏差为1.52%～5.85%;OTC和TE的线性范围为0.5～10 μg/mL，平均回收率为64.1%～94.2%，相对标准偏差为1.23%～4.53%。
2.3 GC-MS检测
与HPLC-UV相比，GC-MS检测更加快速、准确和灵敏，但其需要样品衍生化步骤，因为像CLB类的β-肾上腺素激动剂含有-OH、-NH2或-COOH等类似的极性基团，具沸点高、难挥发等特点，所以GC-MS检测多采用衍生化试剂用来改变样品的这些极性基团，使样品成为极性低、可气化的衍生分析物，然后通過对衍生物的定量实现检测母体瘦肉精的目标。图1为CLB分子结构，图2为CLB衍生化结构式。贾涛[5]应用GC-MS仪器测定猪饲料中的瘦肉精，添加回收率高达88.2%～98.2%，检出限低至0.50 μg/kg。
2.4 免疫分析法
免疫分析法根据抗原或抗体标记物质之间的差异，可以分为荧光免疫分析、酶联免疫法、胶体金免疫分析、化学发光免疫分析及放射免疫分析等。
3 展望
自“瘦肉精事件”后，国家对CLB类瘦肉精的监管力度有所增强，但市场上不断有新型的瘦肉精出现。虽然瘦肉精的预处理和检测技术日渐完善，但仍然存在一定缺陷，使用单一的检测技术不能解决问题，例如HPLC、GC等仪器对瘦肉精的检测虽然灵敏度高，并且假阳性低，使用该类仪器前处理过程比较烦琐且仪器昂贵，对于专业人员的要求也较高，不能满足原位快速检测的技术需求。ELISA克服了上述仪器检测方法的缺陷，但是该种方法检测出来的结果假阳性高，所以应将多种检测技术联合使用，取长补短，不断提高灵敏度，降低检出限。
目前国内外检测瘦肉精的手段技术还没有完全完善，并未建立准确、快速、方便的预处理和检测手段，在线检测瘦肉精就势在必行，瘦肉精的发展趋势可能包括以下两个方面。
（1）纳米材料是非常敏感的生物化学传感器，纳米生物传感器是固定选择性结合靶分子的生物探针的传感器，能够与免疫技术、生物芯片、标记技术等手段结合，快速、高效地检测猪肉中的瘦肉精残留。特异性纳米材料可用于瘦肉精化合物的吸附、提取，并与后续的固相萃取和固相微萃取相结合，同时也可应用于荧光分析和纳米酶等方面。今后随着纳米技术的不断深入发展，传感器将更加的微型化，检测时方便携带，自动化程度也会更高，方便在线检测。
（2）纳米金免疫标记技术是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面，金颗粒的特点是高电子密度，在金标蛋白结合处，可以在显微镜下看见黑褐色的颗粒物，当标记物在相应的配体处出现大量聚集的时候，通过肉眼观察到红色或粉红色斑点，可用于定性或半定量的检测。
相关的部门工作人员应根据不同方法的优缺点，发挥这些技术的长处，保障动物食品安全。随着科技的发展，可以相信未来一定会有更加方便、快速、经济、灵敏的检测方法，更加有效地检测瘦肉精的含量。
参考文献
[1]陈海玲，谢维平.猪肝样品中莱克多巴胺测定的前处理方法[J].分析科学学报，2016，32（3）：435-438.
[2]张絜青，陈煦，刘清.固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定猪肉中瘦肉精方法研究[J].中国卫生检验杂志，2010，20（9）：2182-2183.
[3]KUNPING Y，HUIQUN Z，WENLI H，et al.Rapid screening of toxic salbutamol，ractopamine，and clenbuterol in pork sample by high-performance liquid chromatography-UV method.Journal of Food and Drug Analysis，2016，24（2）：277-283.
[4]金雁，姚家彪，郭隽等.猪肉中克伦特罗、沙丁胺醇、OTC、TE残留量的HPLC同时测定方法研究[J].检验检疫科学，2008（5）：30-33.
[5]贾涛.气相色谱-串联质谱法测定饲料中的瘦肉精[J].饲料与畜牧，2013，6（7）：39-44.