论文部分内容阅读
摘要：目的：建立一个稳定的，易复制的上矢状窦血栓形成 （ SSST） 的动物模型。 方法：将SD大鼠70只随机分为观察组（n=30），对照组（n=30），假手术组（n=30）;大鼠脑静脉结扎与上矢状窦注入Activated Cephaloplastin Reagent相结合为观察组，传统的上矢状窦结扎方法为对照组。在术后6h、24h、72h 分别进行神经功能缺损分级，测定脑水含量及HE染色。结果：观察组较对照组神经功能缺损严重，脑组织含水量明显增加，各组之间比较有统计学意义;其病情发展更符合临床上矢状窦血栓形成病理改变及变化;结论：该造模方法模型成功稳定，易于复制。
关键词：上矢状窦血栓形成;动物模型;神经功能缺损;脑水含量
目前有关静脉窦血栓形成的动物模型制作的方法有多种多样，所选用的动物和栓塞方法也各不相同，目前所建立的各种脑静脉栓塞动物模型的研究结果有较大的差异性和不可复制性。国内外至今仍没有一个较为公认的方案[1]。我们最近采用一种将大鼠脑静脉结扎与上矢状窦注入Activated Cephaloplastin Reagent相结合的方法，动物模型成功率高。
1.材料与方法
1.1实验动物与分组
健康雄性SD大鼠70只，鼠龄3-6个月，体重275-350g，由南华大学实验动物部提供。依照随机数字表分为：观察组：脑静脉（桥静脉）结扎与上矢状窦注入Activated Cephaloplastin Reagent相结合;对照组：单纯上矢状窦中后1/ 3 段结扎，两组在术后6 h、24 h、72 h 再分3小组， 每小组各10只;假手术组大鼠10只， 在6h后取4只， 24h、72h 后各取3只。
1.2 动物模型的制备
观察组和对照组的大鼠均在术前禁食、水，采用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，头部备皮，依次使用碘酒酒精消毒，于颅顶正中作一约1.5cm矢状切口，切开皮肤及皮下组织至颅骨，皮瓣向左右两侧牵开，用高压消毒的干棉球轻轻擦除颅骨外膜。用电钻于后自前以矢状缝为轴，开一约0.5cm*0.3cm骨窗，骨蜡止血，充分暴露SSS并保持硬脑膜完好。于上矢状窦中后1/3处结扎回流静脉（桥静脉），并用27号显微注射器穿刺向SSS（中后1/3段）腔内缓慢注射Activated Cephaloplastin Reagent，1/2h后血栓基本形成，观察10分钟，确定无活动性出血。干棉球清洁伤口，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，酒精消毒。苦味酸标记，大鼠术后保温，待其苏醒后送回动物饲养室饲养。对照组开骨窗暴露SSS并保持硬脑膜完好，单纯做上矢状窦中后1/3处结扎。假手术组仅开骨窗暴露SSS并保持硬脑膜完好，不做栓塞，确定无活动性出血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，酒精消毒。
术后处理：术后两组大鼠均采用自然复温（25-26℃室温）。所有动物的切口均按如下程序处理：先用骨蜡封闭骨窗，然后用庆大霉素生理盐水（160u/ml）冲洗头皮切口，缝合，再用70%酒精擦洗伤口。术毕所有动物均腹腔内注射庆大霉素生理盐水6ml/g，旨在预防感染和补充液体，在大鼠身上用彩笔标记编号，并置于接食物与水源的鼠笼中自由饲养。
1.3 神经功能缺损分级
动物造模后按如下标准进行评分，判断造模成功与否，
物一般情况：观察动物精神、意识状态、饮食、二便、肌力、肌张力和死亡情况。
②动物神经功能缺损分级变化：动物神经功能缺损分级方案参照Bdeersno[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组方案。具体分级标准如下：
0级：正常
I级：一侧肢体轻度无力，略有跋行，可以直线进行或有偏行（半径超过lm）。
Ⅱ级：一侧肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，破行，不能向正前直行，偏行半径在0.5-.075m左右。
Ⅲ级：一侧偏瘫，站立比较困难不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜。
IV级：一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙或抽搐频繁（10分钟内2次以上）。
V级：昏迷或死亡。
1.4脑水含量测定
取栓塞段SSS旁脑组织约0.1g，吸除表面残水，置于称量杯中使用电子天平称取湿重。从开颅取脑到称重完毕控制在 5min内。再将脑组织置电热恒温干燥箱内105℃烘干24h至恒重（两次恒重之差≤0.2mg），称取干重。根据Elliott公式采用干湿法计算脑组织含水量：脑含水量（%）=（湿重一干重）/湿重×100%。
1.5HE染色 取窦旁脑组织一块， 立即置于4% 多聚甲醛溶液中固定72 h， 常规石蜡切片HE 染色后光镜观察。
1.6统计学处理 计量资料采用t检验。计数资料采用秩和检验。
2 结果
2.1神经功能缺损分级
①动物一般情况：实验过程中剔除1大鼠因麻醉意外死亡，3大鼠因颅内水肿明显合并颅内出血死亡，并且补充。大鼠于造模术后均有不同程度的精神萎靡，自洁能力下降，部分大鼠呈昏睡状态;肢体有不同程度的肌张力增加，肌力减弱，反射差，行走跋行，偏向一侧，个别大鼠逆时针绕圈行走。饮食及饮水减少，部分大鼠大小便失禁。假手术组术后当日仅有精神萎靡，肌力、肌张力无变化。
②神经功能缺损分级：各处理组之间两两比较（采用秩和检验）提示：与假手术组比，大鼠神经功能缺损分级具有极显著的差异（P <0.01），观察组与对照组比较，神经功能缺损分级具有差异性（P <0.05）;观察组各时间点比较，神经功能缺损分级有差异性（P <0.05）;对照组各时间点比较：6h与24h相比神经功能缺损分级相似（P>0.05），6h与72h之间比较神经功能缺损分级具有差异性（P <0.05） 表-1 各组大鼠神经功能分级比较
2.2脑水含量测定
观察组手术后6小时脑水肿开始增加，各处理组之间两两比较提示：与假手术组比：P<0.05;观察组与对照组比P<0.01;各时间点之间两两比较提示：观察组各亚组之间比较P<0.05;对照组24h与72h比较 P>0.05;
表-2 各组大鼠脑组织水含量的变化（X±s，%）
2.3脑组织切片HE染色
假手术组皮层神经细胞结构基本正常，仅见个别细胞体积缩小，核深染（图1）;观察组表现为神经元稀疏，细胞间隙增大，并可见大量神经细胞变性坏死，表现为胞体皱缩，核固缩深染，核仁消失，观察组72小时可见颅内出血，红细胞渗出（图2）;而对照组神经细胞存活数量增多，损伤程度明显减轻（图3）。
3.讨论
CVT/VST 临床表现的严重程度取决于静脉闭塞的部位、范围、侧支循环的形成及静脉引流系统的差异[3] ，上矢状窦引流大脑上静脉的血液，因此对大脑皮质的内侧面及上外侧面上部的静脉回流至关重要。目前，上矢状窦闭塞后的病理生理机制仍未完全阐明，病情复杂多变，临床治疗效果差。认识脑静脉及静脉窦闭塞后缺血脑组织病理及生化动态变化的全过程，是深入了解脑损伤的基础，也是确定神经保护时间窗的主要理论依据。其确切的发病机理及栓塞后病理组织变化规律还有待动物实验加以证实。近年来，国外学者致力于制做各种不同的动物模型，以期用动物模型结果来解释CVT的病理生理学改变并指导临床治疗，但不同实验动物模型所得到的结论不尽相同。由于实验动物的选择不同，脑静脉和静脉窦结构复杂，动物个体脑静脉系统变异以及静脉闭塞方法的不同[4-9]，至今仍没有一个较为公认的动物模型制作方案。
本实验采用结扎上矢状窦中后1/3处桥静脉并向SSS（中后1/3段）腔内缓慢注射Activated Cephaloplastin Reagent诱导上矢状窦血栓形成。Activated Cephaloplastin Reagent是临床上应用于检查APTT主要试剂，由德国Siemens Healthcare Diagnostic Inc.生产，其主要成分为脑磷脂和鞣花酸，与多因素共同作用，激活内源性凝血系统，导致血栓形成。 SSS内注射Activated Cephaloplastin Reagent能可靠，完全地闭塞SSS以及桥静脉和皮层静脉。同时结扎桥静脉引起局部血流淤滞，缺氧，导致血管内皮细胞损伤，加速血栓形成。这种方法不是机械性闭塞静脉窦，其血栓形成和发展过程与人类类似，而且术后动物存活率较高相对结扎法额外损伤脑组织程度轻，可对动物模型进行药物干预及对神经功能等进行整体评估。
通过观察，我们发现本法建立动物模型脑静脉性血栓形成的过程为：（l） SSS内注射Activated Cephaloplastin Reagent血栓形成，上矢状窦阻塞，且侧支静脉闭塞，较早出现脑功能障碍，与临床上非单纯脑静脉/静脉窦血栓形成病情严重复杂相符;（2）同时结扎桥静脉，损伤血管内皮细胞，血小板聚集，再次激活内源性及外源性凝血系统，加速血栓形成，其发病机制与人类血栓形成过程中病理生理改变相似，为我们进一步研究和治疗SSST提供有力理论依据。本研究中大鼠SSST造模方法与以往各种动物模型及造模方法比较，具有脑组织或脑血管损伤轻，减少手术损伤导致误差，且重复性及稳定性好等优点。然而该方法对显微手术操作水平及设备条件要求较高，手术过程中结扎桥静脉可能对局部脑组织造成损伤，影响实验结果的精确性。
参考文献：
[1] 唐忠.脑静脉窦闭塞的动物实验研究进展.国际神经病学神经外科学杂志，2006，33（6）：568-570
[2] Bederson JB，Pitts LHI，Dvaes RL，etal. Rat middle cerebral artery occlusion： Evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke，1996，17（3）：472-476.
[3] Bergui M， Bradac GB. Clinical picture of patients with cerebral venous thrombosis and pattern s of dural sinus involvement [J] . Cerebrovasc Dis， 2003， 16（3） ： 211-216
[4] Rottger C， Madlener K， Heil M， etal. Is heparin treatment the optimal management for cerebral venous thrombosis， Effect of abciximab， recombinant tissue plasminogen activator， and enoxaparin in experiment ally induced superior sagittal sinus thrombosis [J] .Stroke， 2005， 36（4）： 841-846.
[5] Ito K， T sugane R， Ikeda A， etal. Cerebral homodynamics and histological changes following acute cerebral venous occlusion in cats[J]Tokai J Exp Clin Med， 1997， 22（ 3）：83-93.
[6] Li ebet rau M， Gabriejcic-Geiger D， Meyer P， et al. Increased calpain express ion following experimental cerebral venous thrombosis in rats [J]. Thromb Res， 2003， 112（4）：239-243.
[7] S challer B， Graf R， Wienhard K， et al. A new animal model of cerebral venous infarction： ligation of the posterior part of the superior sagittal sinus in the cat [J]. Swiss Med Wkly， 2003， 133（29-30） ： 412-418.
[8] Miyamoto K， Heimann A， Kempski O. Microcirculatory alterations in a Mongolian gerbil sinus vein thrombosis model [ J] J Clin Neurosci， 2001， 8 （ Suppl 1） ： 97-105.
[9] 查云飞，孔祥泉，徐海波等. 猫急性脑静脉闭塞模型的建立[ J ]临床放射学杂志， 2005，24（2）：170-173
关键词：上矢状窦血栓形成;动物模型;神经功能缺损;脑水含量
目前有关静脉窦血栓形成的动物模型制作的方法有多种多样，所选用的动物和栓塞方法也各不相同，目前所建立的各种脑静脉栓塞动物模型的研究结果有较大的差异性和不可复制性。国内外至今仍没有一个较为公认的方案[1]。我们最近采用一种将大鼠脑静脉结扎与上矢状窦注入Activated Cephaloplastin Reagent相结合的方法，动物模型成功率高。
1.材料与方法
1.1实验动物与分组
健康雄性SD大鼠70只，鼠龄3-6个月，体重275-350g，由南华大学实验动物部提供。依照随机数字表分为：观察组：脑静脉（桥静脉）结扎与上矢状窦注入Activated Cephaloplastin Reagent相结合;对照组：单纯上矢状窦中后1/ 3 段结扎，两组在术后6 h、24 h、72 h 再分3小组， 每小组各10只;假手术组大鼠10只， 在6h后取4只， 24h、72h 后各取3只。
1.2 动物模型的制备
观察组和对照组的大鼠均在术前禁食、水，采用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，头部备皮，依次使用碘酒酒精消毒，于颅顶正中作一约1.5cm矢状切口，切开皮肤及皮下组织至颅骨，皮瓣向左右两侧牵开，用高压消毒的干棉球轻轻擦除颅骨外膜。用电钻于后自前以矢状缝为轴，开一约0.5cm*0.3cm骨窗，骨蜡止血，充分暴露SSS并保持硬脑膜完好。于上矢状窦中后1/3处结扎回流静脉（桥静脉），并用27号显微注射器穿刺向SSS（中后1/3段）腔内缓慢注射Activated Cephaloplastin Reagent，1/2h后血栓基本形成，观察10分钟，确定无活动性出血。干棉球清洁伤口，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，酒精消毒。苦味酸标记，大鼠术后保温，待其苏醒后送回动物饲养室饲养。对照组开骨窗暴露SSS并保持硬脑膜完好，单纯做上矢状窦中后1/3处结扎。假手术组仅开骨窗暴露SSS并保持硬脑膜完好，不做栓塞，确定无活动性出血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，酒精消毒。
术后处理：术后两组大鼠均采用自然复温（25-26℃室温）。所有动物的切口均按如下程序处理：先用骨蜡封闭骨窗，然后用庆大霉素生理盐水（160u/ml）冲洗头皮切口，缝合，再用70%酒精擦洗伤口。术毕所有动物均腹腔内注射庆大霉素生理盐水6ml/g，旨在预防感染和补充液体，在大鼠身上用彩笔标记编号，并置于接食物与水源的鼠笼中自由饲养。
1.3 神经功能缺损分级
动物造模后按如下标准进行评分，判断造模成功与否，
物一般情况：观察动物精神、意识状态、饮食、二便、肌力、肌张力和死亡情况。
②动物神经功能缺损分级变化：动物神经功能缺损分级方案参照Bdeersno[2]及爱丁堡与斯堪的那维亚研究组方案。具体分级标准如下：
0级：正常
I级：一侧肢体轻度无力，略有跋行，可以直线进行或有偏行（半径超过lm）。
Ⅱ级：一侧肢体明显无力，头部轻度向另侧歪斜，破行，不能向正前直行，偏行半径在0.5-.075m左右。
Ⅲ级：一侧偏瘫，站立比较困难不能行走，但可以正卧位，有显著的歪头、口角歪斜。
IV级：一侧偏瘫，不能正卧，呈侧卧甚至仰卧，歪头及身体扭曲明显，或不能自主进食，神志迷蒙或抽搐频繁（10分钟内2次以上）。
V级：昏迷或死亡。
1.4脑水含量测定
取栓塞段SSS旁脑组织约0.1g，吸除表面残水，置于称量杯中使用电子天平称取湿重。从开颅取脑到称重完毕控制在 5min内。再将脑组织置电热恒温干燥箱内105℃烘干24h至恒重（两次恒重之差≤0.2mg），称取干重。根据Elliott公式采用干湿法计算脑组织含水量：脑含水量（%）=（湿重一干重）/湿重×100%。
1.5HE染色 取窦旁脑组织一块， 立即置于4% 多聚甲醛溶液中固定72 h， 常规石蜡切片HE 染色后光镜观察。
1.6统计学处理 计量资料采用t检验。计数资料采用秩和检验。
2 结果
2.1神经功能缺损分级
①动物一般情况：实验过程中剔除1大鼠因麻醉意外死亡，3大鼠因颅内水肿明显合并颅内出血死亡，并且补充。大鼠于造模术后均有不同程度的精神萎靡，自洁能力下降，部分大鼠呈昏睡状态;肢体有不同程度的肌张力增加，肌力减弱，反射差，行走跋行，偏向一侧，个别大鼠逆时针绕圈行走。饮食及饮水减少，部分大鼠大小便失禁。假手术组术后当日仅有精神萎靡，肌力、肌张力无变化。
②神经功能缺损分级：各处理组之间两两比较（采用秩和检验）提示：与假手术组比，大鼠神经功能缺损分级具有极显著的差异（P <0.01），观察组与对照组比较，神经功能缺损分级具有差异性（P <0.05）;观察组各时间点比较，神经功能缺损分级有差异性（P <0.05）;对照组各时间点比较：6h与24h相比神经功能缺损分级相似（P>0.05），6h与72h之间比较神经功能缺损分级具有差异性（P <0.05） 表-1 各组大鼠神经功能分级比较
2.2脑水含量测定
观察组手术后6小时脑水肿开始增加，各处理组之间两两比较提示：与假手术组比：P<0.05;观察组与对照组比P<0.01;各时间点之间两两比较提示：观察组各亚组之间比较P<0.05;对照组24h与72h比较 P>0.05;
表-2 各组大鼠脑组织水含量的变化（X±s，%）
2.3脑组织切片HE染色
假手术组皮层神经细胞结构基本正常，仅见个别细胞体积缩小，核深染（图1）;观察组表现为神经元稀疏，细胞间隙增大，并可见大量神经细胞变性坏死，表现为胞体皱缩，核固缩深染，核仁消失，观察组72小时可见颅内出血，红细胞渗出（图2）;而对照组神经细胞存活数量增多，损伤程度明显减轻（图3）。
3.讨论
CVT/VST 临床表现的严重程度取决于静脉闭塞的部位、范围、侧支循环的形成及静脉引流系统的差异[3] ，上矢状窦引流大脑上静脉的血液，因此对大脑皮质的内侧面及上外侧面上部的静脉回流至关重要。目前，上矢状窦闭塞后的病理生理机制仍未完全阐明，病情复杂多变，临床治疗效果差。认识脑静脉及静脉窦闭塞后缺血脑组织病理及生化动态变化的全过程，是深入了解脑损伤的基础，也是确定神经保护时间窗的主要理论依据。其确切的发病机理及栓塞后病理组织变化规律还有待动物实验加以证实。近年来，国外学者致力于制做各种不同的动物模型，以期用动物模型结果来解释CVT的病理生理学改变并指导临床治疗，但不同实验动物模型所得到的结论不尽相同。由于实验动物的选择不同，脑静脉和静脉窦结构复杂，动物个体脑静脉系统变异以及静脉闭塞方法的不同[4-9]，至今仍没有一个较为公认的动物模型制作方案。
本实验采用结扎上矢状窦中后1/3处桥静脉并向SSS（中后1/3段）腔内缓慢注射Activated Cephaloplastin Reagent诱导上矢状窦血栓形成。Activated Cephaloplastin Reagent是临床上应用于检查APTT主要试剂，由德国Siemens Healthcare Diagnostic Inc.生产，其主要成分为脑磷脂和鞣花酸，与多因素共同作用，激活内源性凝血系统，导致血栓形成。 SSS内注射Activated Cephaloplastin Reagent能可靠，完全地闭塞SSS以及桥静脉和皮层静脉。同时结扎桥静脉引起局部血流淤滞，缺氧，导致血管内皮细胞损伤，加速血栓形成。这种方法不是机械性闭塞静脉窦，其血栓形成和发展过程与人类类似，而且术后动物存活率较高相对结扎法额外损伤脑组织程度轻，可对动物模型进行药物干预及对神经功能等进行整体评估。
通过观察，我们发现本法建立动物模型脑静脉性血栓形成的过程为：（l） SSS内注射Activated Cephaloplastin Reagent血栓形成，上矢状窦阻塞，且侧支静脉闭塞，较早出现脑功能障碍，与临床上非单纯脑静脉/静脉窦血栓形成病情严重复杂相符;（2）同时结扎桥静脉，损伤血管内皮细胞，血小板聚集，再次激活内源性及外源性凝血系统，加速血栓形成，其发病机制与人类血栓形成过程中病理生理改变相似，为我们进一步研究和治疗SSST提供有力理论依据。本研究中大鼠SSST造模方法与以往各种动物模型及造模方法比较，具有脑组织或脑血管损伤轻，减少手术损伤导致误差，且重复性及稳定性好等优点。然而该方法对显微手术操作水平及设备条件要求较高，手术过程中结扎桥静脉可能对局部脑组织造成损伤，影响实验结果的精确性。
参考文献：
[1] 唐忠.脑静脉窦闭塞的动物实验研究进展.国际神经病学神经外科学杂志，2006，33（6）：568-570
[2] Bederson JB，Pitts LHI，Dvaes RL，etal. Rat middle cerebral artery occlusion： Evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke，1996，17（3）：472-476.
[3] Bergui M， Bradac GB. Clinical picture of patients with cerebral venous thrombosis and pattern s of dural sinus involvement [J] . Cerebrovasc Dis， 2003， 16（3） ： 211-216
[4] Rottger C， Madlener K， Heil M， etal. Is heparin treatment the optimal management for cerebral venous thrombosis， Effect of abciximab， recombinant tissue plasminogen activator， and enoxaparin in experiment ally induced superior sagittal sinus thrombosis [J] .Stroke， 2005， 36（4）： 841-846.
[5] Ito K， T sugane R， Ikeda A， etal. Cerebral homodynamics and histological changes following acute cerebral venous occlusion in cats[J]Tokai J Exp Clin Med， 1997， 22（ 3）：83-93.
[6] Li ebet rau M， Gabriejcic-Geiger D， Meyer P， et al. Increased calpain express ion following experimental cerebral venous thrombosis in rats [J]. Thromb Res， 2003， 112（4）：239-243.
[7] S challer B， Graf R， Wienhard K， et al. A new animal model of cerebral venous infarction： ligation of the posterior part of the superior sagittal sinus in the cat [J]. Swiss Med Wkly， 2003， 133（29-30） ： 412-418.
[8] Miyamoto K， Heimann A， Kempski O. Microcirculatory alterations in a Mongolian gerbil sinus vein thrombosis model [ J] J Clin Neurosci， 2001， 8 （ Suppl 1） ： 97-105.
[9] 查云飞，孔祥泉，徐海波等. 猫急性脑静脉闭塞模型的建立[ J ]临床放射学杂志， 2005，24（2）：170-173