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摘 要：宏基因组学在探索新的基因和物种、调查微生物群落结构和功能上取得了很大成就，被廣泛应用于各个领域。本文以酸性矿山废水为例，论述宏基因组学技术在环境中微生物群落结构以及抗生素抗性基因分布研究中的应用。
关键词：宏基因组学;微生物群落结构;AMD;抗性基因
宏基因组学在探索新的基因和物种、调查微生物群落结构和功能上取得了很大的成就，广泛地应用于各个领域。酸性矿山废水（Acidminedrainage，AMD）中含有很高浓度的硫酸根以及有毒的重金属离子，会造成地表水和地下水的污染，同时也危及人类的生命健康[1]。为了防控这种污染的进一步危害，需要了解AMD中微生物群落的组成结构以及适应环境变化的能力[2]。因此，本文以宏基因组学在AMD环境微生物群落结构及抗生素抗性基因分布研究中的应用为主，进行综合论述。
一、宏基因组学概述
目前，较完善的组学方法是以高通量测序技术（罗氏454测序技术和Illumina测序技术）和基因芯片（GeoChip）技术为主要技术的宏基因组学。基因芯片技术用核酸序列检测核酸探针杂交，能够有所侧重地得到已经知道的物种或者他们发挥作用的基因信息。通过系统分析，可以知道这个物种或作用分布在哪里，这过程中会遇到功能基因的干扰，无法发现未知基因有哪些相似点，故难以定义到新基因，更无法估算生物环境中的物种和个体总量。若合理利用高通量测序技术，将比较容易地获得某一特定基因的大量操作分类单元（OTU）及其个体数量或者宏基因组中的大片段DNA信息，以此近一步深入了解生境中微生物群落的组成、结构以及遗传进化关系等。两种技术不仅能互相填补优缺点，共同为研究提供大量数据，还是原位微生物群落功能结构和代谢功能的数据来源。
二、宏基因组学在AMD研究中的应用
（一）AMD环境下微生物群落结构研究
传统意义上，针对微生物群落的分析方法是先对微生物进行分离，然后鉴定微生物的生理生化性质，以此判断出微生物所属种类。在酸性环境中与利用微生物催化的浸矿技术中，有着许多自养型嗜酸性细菌，这些细菌需要在自然的环境下才能存活，靠着人工的固体培养基是无法存活的。实际上，荧光原位杂交法（FISH）、变性梯度凝胶电泳法（DGGE）和PCR克隆法等一些生物技术，都被用于研究传统微生物群落的多样性。但是在分析微生物群落结构和活动的分子生物学方面，这些研究方法有着劳动强度过大的严重缺点。因此运用最多的是基因芯片技术[1]。
而微生物法运用自然环境的硫循环原理，把重金属离子缓慢储藏在微生物体内。具体过程为先进行硫酸盐还原菌的生物还原反应，然后把硫酸盐一步步变为单质硫。国外许多研究人员利用微生物法处理矿山酸性废水，如美国蒙大拿州有人尝试将硫化还原菌运用到矿山酸性废水处理中，最终让出水pH值成功控制在7.0左右，且Fe、Al、Cd和Cu的去除率也很高[3]。国内处理含硫酸根的酸性废水时，常采取石灰乳中和的方法，若酸性废水的pH值低于正常值，原先的石灰乳中和法在处理每吨废水时所需石灰量大、处理成本高，还会产生许多废渣，可能带给环境二次污染[4-5]。
（二）抗性基因研究
基因是遗传信息的载体，可以实现自我复制，将遗传信息传给下一代。AMD寡营养生态系统中的微生物群落中有着能够和重金属胁迫、酸胁迫以及胞内氧化相抵抗的有关基因，能够让微生物拥有抵抗力，在外界极端条件情况下存活[7]。而比起抗生素抗性基因的研究，现阶段重金属抗性基因在各种环境中的传播、分布特征及转归机制的研究少之又少[8]。
2.2.1 AMD中存在的天然抗性基因
在AMD中起抑制作用的重金属离子可以毒化细菌的生长，但因为生长环境比较特殊，这让浸矿微生物有较高的抵抗能力对抗许多金属离子，这也使得A.ferroxidans被用来浸出铀矿、铜矿、镍矿等多种金属硫化矿。有学者发现古菌与其他细菌之间的差异，主要是在氢离子胁迫的相关基因上与其他种群相比有较高的表达，这可以得出古菌在pH低的胁迫下可以更好的适应这种状态，分析的原因可能是古菌虽然不断的进化，但是却留下了能够抵抗氢离子胁迫的原始基因[8]。
2.2.2 抗生素、重金属抗性基因获得方式
现有研究表明，在质粒或转座子中，找到了能与重金属对抗的抗性基因，并且细菌得到抗性基因的方式是通过抗性基因的水平转移[8]。如SXT/R391家族中可变区基因的编码产物对抗宿主抗生素的耐药性、重金属离子抗性等，有着高转移频率和宽宿主范围[9]。
研究表明，在AMD中长期存在的生物具有一些比较特别的基因存在（例如参与重金属抵御的基因）。根据16SrRNA基因的信息发现，这些生物高度相似于新形成的在AMD环境中的微生物，但是在地理方面，有很远距离。这种微生物间的迁移机制目前还没有发现奥秘，谱系间跨越时间尺度地理隔离的生存模式的相互关系却可能依赖于此[9]。
2.2.3细菌抗生素抗性与重金属抗性
2.2.3.1协同抗性
有着相同抗性遗传载体的抗生素抗性基因和重金属抗性基因，这两种抗性基因的相关性是正相关，一种增多，另一种会随之增多。例如链霉素抗性基因（strB）和汞抗性基因（merE）这两种抗性基因在质粒pHCM1上存活，故其中任意一个基因的增加，紧跟着另一个基因会相同规模的增加[10-12]。
2.2.3.2交叉抗性
细菌细胞需要在相同抗性系统中，才能形成抗生素和重金属的抗性。比如：TetL蛋白在向外界排出四环素（Tet）的同时，还能排出Co2+。
2.2.4 外界PH值同抗酸基因表达的优劣地位
微生物在AMD不断酸化的过程中的作用主要在于通过铁硫氧化降解矿物获得能量，导致pH持续降低，到一定阈值时，由于其抗酸基因表达并不强势，导致优势地位可能逐步减弱的假设[11]。 三、 总结
宏基因组学不单单用传統意义上的纯培养技术，而是用非培养的方法，在有机选择新的生物活性物质的机率上有了进步，许多新的生物活性物质（酶和抗生素等）利用该方法得以发现。
宏基因组学在探索新的基因和物种、调查微生物群落结构和功能上取得了很大的成就。在微生物领域和环境科学与工程领域内，已经变成了一个热点和前沿内容，比如全球气候变化、生物地理分布、海洋环境研究、农业生态系统、人体共生微生物等，特别是生物修复和资源开发，每一处都彰显出其强大的潜力。
参考文献：
[1]Zhang R B，Wei M M，Ji H G，et al.Application of real—time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（6）：116l-1168.
[2]詹婧.自然生态恢复过程中铜尾矿废弃地微生物学性质及细菌群落结构研究[D].合肥：安徽大学，2010.
[3]宣淮翔.铜尾矿不同氧化层中为生物多样性研究[D].合肥：安徽大学，2011.
[4]Hitch TCA， Thomas BJ， Friedersdorff JCA， et al. Deep sequence analysis reveals the ovine rumen as a reservoir of antibiotic resistance genes[J].Environmental Pollution，2018，235：571-575.
[5]Haley B J， Kim S W， Cao H， et al. 265 Genomic and metagenomic analysis of antibiotic resistance in dairy animals[J].Journal of Animal Science，2017，95（S4）：131.
[6]Ju F， Zhang T. Experimental design and bioinformatics analysis for the application of metagenomics in environmental sciences and biotechnology[J].Environmental Science&Technology，2015，49：12628-12640.
[7]孙欣，高莹，杨云锋.环境微生物的宏基因组学研究新进展[J].Biodiversity Science，2013，21（4）：393-400.
[8]韩玉姣.凡口铅锌尾矿酸性废水微生物宏基因组及宏转录组研究[J].广东：中山大学，2013.
[9]周围，李友国，程国军，等.1株抗重金属铬细菌的分离?鉴定及抗性基因型的初步研究[J].华中农业大学学报，2008，27（2）：248-250.
[10]罗鹏，何香燕，胡超群.细菌整合性接合元件SXT/8391研究进展[J].微生物学，2014（5）：472-473.
[11]宋超，郑春丽，王建英.微生物硫酸盐的同化途径及其与重金属抗性的关系[J].安徽农业科学，2012，40（11）：6368-6370，6400.
作者简介：
陈炬蓉（1997—）女，籍贯：浙江丽水，本科在读，研究方向：预防医学。
关键词：宏基因组学;微生物群落结构;AMD;抗性基因
宏基因组学在探索新的基因和物种、调查微生物群落结构和功能上取得了很大的成就，广泛地应用于各个领域。酸性矿山废水（Acidminedrainage，AMD）中含有很高浓度的硫酸根以及有毒的重金属离子，会造成地表水和地下水的污染，同时也危及人类的生命健康[1]。为了防控这种污染的进一步危害，需要了解AMD中微生物群落的组成结构以及适应环境变化的能力[2]。因此，本文以宏基因组学在AMD环境微生物群落结构及抗生素抗性基因分布研究中的应用为主，进行综合论述。
一、宏基因组学概述
目前，较完善的组学方法是以高通量测序技术（罗氏454测序技术和Illumina测序技术）和基因芯片（GeoChip）技术为主要技术的宏基因组学。基因芯片技术用核酸序列检测核酸探针杂交，能够有所侧重地得到已经知道的物种或者他们发挥作用的基因信息。通过系统分析，可以知道这个物种或作用分布在哪里，这过程中会遇到功能基因的干扰，无法发现未知基因有哪些相似点，故难以定义到新基因，更无法估算生物环境中的物种和个体总量。若合理利用高通量测序技术，将比较容易地获得某一特定基因的大量操作分类单元（OTU）及其个体数量或者宏基因组中的大片段DNA信息，以此近一步深入了解生境中微生物群落的组成、结构以及遗传进化关系等。两种技术不仅能互相填补优缺点，共同为研究提供大量数据，还是原位微生物群落功能结构和代谢功能的数据来源。
二、宏基因组学在AMD研究中的应用
（一）AMD环境下微生物群落结构研究
传统意义上，针对微生物群落的分析方法是先对微生物进行分离，然后鉴定微生物的生理生化性质，以此判断出微生物所属种类。在酸性环境中与利用微生物催化的浸矿技术中，有着许多自养型嗜酸性细菌，这些细菌需要在自然的环境下才能存活，靠着人工的固体培养基是无法存活的。实际上，荧光原位杂交法（FISH）、变性梯度凝胶电泳法（DGGE）和PCR克隆法等一些生物技术，都被用于研究传统微生物群落的多样性。但是在分析微生物群落结构和活动的分子生物学方面，这些研究方法有着劳动强度过大的严重缺点。因此运用最多的是基因芯片技术[1]。
而微生物法运用自然环境的硫循环原理，把重金属离子缓慢储藏在微生物体内。具体过程为先进行硫酸盐还原菌的生物还原反应，然后把硫酸盐一步步变为单质硫。国外许多研究人员利用微生物法处理矿山酸性废水，如美国蒙大拿州有人尝试将硫化还原菌运用到矿山酸性废水处理中，最终让出水pH值成功控制在7.0左右，且Fe、Al、Cd和Cu的去除率也很高[3]。国内处理含硫酸根的酸性废水时，常采取石灰乳中和的方法，若酸性废水的pH值低于正常值，原先的石灰乳中和法在处理每吨废水时所需石灰量大、处理成本高，还会产生许多废渣，可能带给环境二次污染[4-5]。
（二）抗性基因研究
基因是遗传信息的载体，可以实现自我复制，将遗传信息传给下一代。AMD寡营养生态系统中的微生物群落中有着能够和重金属胁迫、酸胁迫以及胞内氧化相抵抗的有关基因，能够让微生物拥有抵抗力，在外界极端条件情况下存活[7]。而比起抗生素抗性基因的研究，现阶段重金属抗性基因在各种环境中的传播、分布特征及转归机制的研究少之又少[8]。
2.2.1 AMD中存在的天然抗性基因
在AMD中起抑制作用的重金属离子可以毒化细菌的生长，但因为生长环境比较特殊，这让浸矿微生物有较高的抵抗能力对抗许多金属离子，这也使得A.ferroxidans被用来浸出铀矿、铜矿、镍矿等多种金属硫化矿。有学者发现古菌与其他细菌之间的差异，主要是在氢离子胁迫的相关基因上与其他种群相比有较高的表达，这可以得出古菌在pH低的胁迫下可以更好的适应这种状态，分析的原因可能是古菌虽然不断的进化，但是却留下了能够抵抗氢离子胁迫的原始基因[8]。
2.2.2 抗生素、重金属抗性基因获得方式
现有研究表明，在质粒或转座子中，找到了能与重金属对抗的抗性基因，并且细菌得到抗性基因的方式是通过抗性基因的水平转移[8]。如SXT/R391家族中可变区基因的编码产物对抗宿主抗生素的耐药性、重金属离子抗性等，有着高转移频率和宽宿主范围[9]。
研究表明，在AMD中长期存在的生物具有一些比较特别的基因存在（例如参与重金属抵御的基因）。根据16SrRNA基因的信息发现，这些生物高度相似于新形成的在AMD环境中的微生物，但是在地理方面，有很远距离。这种微生物间的迁移机制目前还没有发现奥秘，谱系间跨越时间尺度地理隔离的生存模式的相互关系却可能依赖于此[9]。
2.2.3细菌抗生素抗性与重金属抗性
2.2.3.1协同抗性
有着相同抗性遗传载体的抗生素抗性基因和重金属抗性基因，这两种抗性基因的相关性是正相关，一种增多，另一种会随之增多。例如链霉素抗性基因（strB）和汞抗性基因（merE）这两种抗性基因在质粒pHCM1上存活，故其中任意一个基因的增加，紧跟着另一个基因会相同规模的增加[10-12]。
2.2.3.2交叉抗性
细菌细胞需要在相同抗性系统中，才能形成抗生素和重金属的抗性。比如：TetL蛋白在向外界排出四环素（Tet）的同时，还能排出Co2+。
2.2.4 外界PH值同抗酸基因表达的优劣地位
微生物在AMD不断酸化的过程中的作用主要在于通过铁硫氧化降解矿物获得能量，导致pH持续降低，到一定阈值时，由于其抗酸基因表达并不强势，导致优势地位可能逐步减弱的假设[11]。 三、 总结
宏基因组学不单单用传統意义上的纯培养技术，而是用非培养的方法，在有机选择新的生物活性物质的机率上有了进步，许多新的生物活性物质（酶和抗生素等）利用该方法得以发现。
宏基因组学在探索新的基因和物种、调查微生物群落结构和功能上取得了很大的成就。在微生物领域和环境科学与工程领域内，已经变成了一个热点和前沿内容，比如全球气候变化、生物地理分布、海洋环境研究、农业生态系统、人体共生微生物等，特别是生物修复和资源开发，每一处都彰显出其强大的潜力。
参考文献：
[1]Zhang R B，Wei M M，Ji H G，et al.Application of real—time PCR to monitor population dynamics of defined mixed cultures of moderate thermophiles involved in bioleaching of chalcopyrite[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（6）：116l-1168.
[2]詹婧.自然生态恢复过程中铜尾矿废弃地微生物学性质及细菌群落结构研究[D].合肥：安徽大学，2010.
[3]宣淮翔.铜尾矿不同氧化层中为生物多样性研究[D].合肥：安徽大学，2011.
[4]Hitch TCA， Thomas BJ， Friedersdorff JCA， et al. Deep sequence analysis reveals the ovine rumen as a reservoir of antibiotic resistance genes[J].Environmental Pollution，2018，235：571-575.
[5]Haley B J， Kim S W， Cao H， et al. 265 Genomic and metagenomic analysis of antibiotic resistance in dairy animals[J].Journal of Animal Science，2017，95（S4）：131.
[6]Ju F， Zhang T. Experimental design and bioinformatics analysis for the application of metagenomics in environmental sciences and biotechnology[J].Environmental Science&Technology，2015，49：12628-12640.
[7]孙欣，高莹，杨云锋.环境微生物的宏基因组学研究新进展[J].Biodiversity Science，2013，21（4）：393-400.
[8]韩玉姣.凡口铅锌尾矿酸性废水微生物宏基因组及宏转录组研究[J].广东：中山大学，2013.
[9]周围，李友国，程国军，等.1株抗重金属铬细菌的分离?鉴定及抗性基因型的初步研究[J].华中农业大学学报，2008，27（2）：248-250.
[10]罗鹏，何香燕，胡超群.细菌整合性接合元件SXT/8391研究进展[J].微生物学，2014（5）：472-473.
[11]宋超，郑春丽，王建英.微生物硫酸盐的同化途径及其与重金属抗性的关系[J].安徽农业科学，2012，40（11）：6368-6370，6400.
作者简介：
陈炬蓉（1997—）女，籍贯：浙江丽水，本科在读，研究方向：预防医学。