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摘要 [目的]建立一种同时测定水产品中泰妙菌素和沃尼妙林农药残留的分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法。[方法]样品经乙腈进行提取，PSA为吸附剂进行分散固相萃取净化，C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分离，水溶液（含0.05%甲酸、5 mmol/L乙酸铵）∶乙腈=（85∶15）为初始流动相，结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）定性定量分析。[结果]添加样品的回收率为82.5% ～95.4%，相对标准偏差在3.0% ～11.2%，最低检出限为0.1 μg/kg。[结论]该方法精密度、灵敏度、回收率均能满足水产品中泰妙菌素和沃尼妙林的快速分析测定。
关键词 分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱;水产品;泰妙菌素;沃尼妙林
中图分类号 O657.6;TS254.7文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）10-0164-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.044
Abstract [Objective] The research aimed to establish a dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS） for the simultaneous determination of tiamulin and valnemulin residues in aquatic products.[Method]The samples were extracted by acetonitrile，purified by PSA as adsorbent，separated by C18 column （2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），water solution（0.05% formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate）∶acetonitrile=（85∶15） as the initial mobile phase，and analyzed by UPLCMS/MS.[Result]The recovery rate of the added sample was 82.5%-95.4%，the relative standard deviation was 3.0%-11.2%，and the detection limit of this method was 0.1 μg/kg.[Conclusion]The precision，sensitivity and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of tiamulin and valnemulin in aquatic products.
Key words Dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS）;Aquatic products;Tiamulin;Valnemulin
20世50年代，学者从高等真菌Pleurotus multilus（Fr.）Sacc.和P.passecke-rianus Pilat中提取截短侧耳素，这是具有抗菌活性的双萜类化合物，它包括一个含有8个手性碳原子的5-6-8三元环骨架和一个乙醇酸酯侧链[1]。泰妙菌素、沃尼妙林是经过化学修饰后，具有很强抗耐药菌活性的截短侧耳素类药物，最早用于防治革兰氏阳性细菌、支原体等疾病的。泰妙菌素和沃尼妙林具有抗菌谱广、毒性小等特点，对生殖支原体、猪密螺旋体以及水产品都有良好的抗菌性[2]。研究表明，少量使用泰妙菌素和沃尼妙林，能够促进水产品的生长，减少病虫害的危害。但是在实际生产养殖过程中，存在着滥用泰妙菌素和沃尼妙林的现象，大量地使用泰妙菌素和沃尼妙林会使水产品体内蓄积并导致无法完全代谢，最终通过水产品消费进入人体并带来潜在危害[3-5]。我国农业部235公告中对猪、兔、鸡中泰妙菌素的残留作出了严格的规定，但对水产品中的泰妙菌素和沃尼妙林还未有明确限量规定。因此建立一种方便、有效、准确的检测方法极为重要，以便研究水产品中泰妙菌素和沃尼妙林的给药量和休药期。
目前据已有文献报道，泰妙菌素和沃尼妙林的检测方法主要有气相色谱法（GC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-10]和高效液相色譜-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[11-15]等，超高效液相色谱-串联质谱法拥有超高效液相快速、有效的分离能力和串联质谱的精准灵敏度，是一种快速发展的分析技术[16]。将超高效液相色谱-串联质谱法与国际上通用的分散固相萃取技术[17]相结合，兼具两者的优点，可以真正实现多种兽药残留的快速检测。 笔者使用分散固相萃取技术进行前处理，超高效液相色谱-串联质谱法为检测方法，实现了泰妙菌素和沃尼妙林等兽药残留的快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准品：泰妙菌素、沃尼妙林（纯度均>98%），美国Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸铵，色谱纯，德国Merck公司;PSA（粒径50 μm）、氨水（分析纯），上海国药集团。 准确称取泰妙菌素和沃尼妙林标准品1 mg，用甲醇溶解定容至50 mL，配成20 μg/mL的中间使用液，于-18 ℃下避光保存待用。
1.2 儀器与设备
ACQUITYTM 超高效液相色谱仪、XEVO TQS三重四极杆质谱仪，美国Waters公司;ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美国Waters公司;N-EVAP-112氮吹仪，美国Organomation公司;3-30K 高速冷冻离心机，Sigma公司;MX-S 涡旋搅拌器，美国Scilogex公司。
1.3 UPLC-MS/MS条件
1.3.1 色谱条件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温30 ℃;进样量5 μL;流动相：A为水溶液（含0.05%甲酸、5 mmol/L乙酸铵），B为乙腈;流速0.25 mL/min;洗脱条件：0～0.5 min，15% B;0.5～1.5 min，15%～65% B;1.5～4.0 min，65% B;4.0～4.5 min，65%～15% B;4.5～5.0 min，15% B。
1.3.2 质谱条件。电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：多反应监测（MRM），正离子模式;毛细管电压3.0 kV;离子源温度120 ℃;脱溶剂气温度350 ℃;干燥气体流速800 L/h;碰撞池压力0.3 Pa。泰妙菌素和沃尼妙林的质谱参数如表1所示。
1.4 样品前处理
1.4.1 提取。取已均质鱼肉1.0 g于50 mL离心管中，加10 mL乙腈超声提取10 min，取出恢复至室温，6 000 r/min离心5 min，全部上清液转移至新的离心管。重复以上操作提取一次，合并后加乙腈至25 mL，待净化。
1.4.2 净化。取乙腈提取液10 mL于预先加有PSA 30 mg的离心管中，涡旋2 min，随后6 000 r/min离心5 min。
1.4.3 浓缩、转溶。吸取5 mL上清液于40 ℃下氮吹，用1.0 mL 流动相A∶B=（ 8.5∶1.5，V∶V）溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS上机检测分析。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
20 μg/mL的混合标准溶液以10 μL/min 的流速进入离子源，在ESI+离子化模式下进行一级质谱全扫描，对毛细管电压和锥孔电压进行优化，确定泰妙菌素和沃尼妙林的锥孔电压分别为32和12 V。用二级质谱将母离子击碎，选取经碰撞后响应值最高的2个子离子分别为定量离子和定性离子，并调查碰撞能量大小，使母离子与子离子响应值达到最佳响应值。泰妙菌素和沃尼妙林的二级质谱图如图1所示。
2.2 色谱条件的优化 该试验以ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为2种化合物的色谱分析柱，分别选择乙腈-水、甲醇-水、水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵）-乙腈体系以及水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵）-甲醇体系作为流动相，发现乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但乙腈作为有机相时峰形比甲醇好，响应值高，同时在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸铵，改善了被待测物质的峰形，这是由于有机酸和挥发性盐提高了他们的分离度和离子化效率，图2为待测物质的MRM图。
2.3 前处理优化
2.3.1 提取条件的优化。泰妙菌素、沃尼妙林极性偏弱，且易溶于甲醇、乙醇和水等溶剂。试验选取乙腈、丙酮、乙酸乙酯和甲醇4种提取溶剂进行比较，4种溶剂提取效率如图3所示。
试验表明，乙酸乙酯提取，泰妙菌素回收率较好（91.5%），但对沃尼妙林提取回收率较低（83.1%），且部分油脂被萃取到提取液中，对（UPLC-MS/MS） 仪器响应值有明显的抑制作用。乙腈提取2种物质回收率（泰妙菌素88.3%、沃尼妙林86.4%）都高于甲醇和丙酮，且受基质影响较小，故选择乙腈超声10 min，提取2次保证提取率的最大化。
2.3.2 净化条件的选择。
目前，在对泰妙菌素和沃尼妙林报道的已有文献中，多以HLB、C18等SPE净化柱为主，且活化所用磷酸盐缓冲液所造成的酸性环境可能会造成待测药物的损失[18]。该试验以分散固相萃取为前处理方式，对HLB、MAX这2种净化柱和PSA、C18进行对比，净化效果见图4。
结果表明，弱阳离子（HLB、C18）等SPE柱净化回收率一般，弱阴离子（MAX）可能因为对泰妙菌素、沃尼妙林的吸附性能较强，导致回收率降低。PSA能够去除样品中的脂肪酸、糖类物质等不同杂质，对泰妙菌素和沃尼妙林的吸附作用较小，平均回收率高于SPE的方法，并且净化效果明显，故选取PSA比较合适。
2.3.3 吸附剂使用量的优化。
分别将10、20、30、40、50、60、70和80 mg的PSA用于净化试验，比较PSA不同使用量的净化效果，结果表明（图5），当PSA用量为10～20 mg时，目标物质回收率在106.2%～112.3%，分析原因可能是PSA使用量太少，样品中残有脂肪酸和糖类等物质，基质干扰物未除完全，对目标分子产生基质作用。当使用量在30～50 mg，回收率趋于平稳，在80%左右，此时PSA使用量足够吸附杂质，且对目标物质回收率无较大干扰。当PSA使用量继续增大，回收率开始较低，分析原因可能PSA中氨基游离出来，与目标物质中某些基团发生化学反应。综上所述，选择PSA的使用量为30 mg，既保证了净化后样品的纯净，又避免样品在净化过程中过量损失。 2.4 方法学验证
2.4.1 检出限、定量限及线性关系。
取鲫鱼空白样品，按照“1.4”的前处理方法，得到空白基质溶液，配成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的空白基质混合标准工作液，以待测物质的峰面积（y）和相应的浓度（x）绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。根据7个空白样品的基线噪音求其平均值，按3倍信噪比计算其方法检测限（LOD），10倍信噪比计算其方法定量限（LOQ）。2种化合物的线性方程、检出限和定量限见表2。
2.4.2 回收率和精密度。
通过加标回收试验来评价方法的准确性、精密度和回收率。在前处理前，将混合标准溶液加入到1 g草鱼基质中，然后按照“1.4”方法进行前处理。 其中，混合标准工作液分为1.0、2.0、5.0 ng/mL这3个水平，每个平行测定6次。分析结果见表3，测得回收率为82.5%～95.4%，相对标准偏差（RSD）≤9.1%，由此表明该方法重现性、准确性好，精密度、回收率高，能够满足日常检测的要求。
2.5 实际样品检测
用2 mg/L的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液连续药浴60条鲫鱼14 d。利用已建立的方法进行鲫鱼体内泰妙菌素和沃尼妙林残留量的测定，结果发现（图6）鲫鱼的各个组织中均能检测到泰妙菌素和沃尼妙林的残留。表明该研究方法能够同时测定水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量。
3 结论
该试验采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法建立了同时测定泰妙菌素和沃尼妙林的分析方法，通过仪器条件、提取方式和PSA净化条件的优化，提高试验效率，该方法的检出限为0.1 μg/kg，回收率在82.5% ～95.4%，方法学评价表明该方法具有灵敏度高、准确性好、重现性好、适用性强，而且检出限、定量限以及回收率均能满足水产品质量检测要求的优点，加强了分散固相萃取前处理方式在水产品领域的应用。
参考文献
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关键词 分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱;水产品;泰妙菌素;沃尼妙林
中图分类号 O657.6;TS254.7文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）10-0164-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.044
Abstract [Objective] The research aimed to establish a dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS） for the simultaneous determination of tiamulin and valnemulin residues in aquatic products.[Method]The samples were extracted by acetonitrile，purified by PSA as adsorbent，separated by C18 column （2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），water solution（0.05% formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate）∶acetonitrile=（85∶15） as the initial mobile phase，and analyzed by UPLCMS/MS.[Result]The recovery rate of the added sample was 82.5%-95.4%，the relative standard deviation was 3.0%-11.2%，and the detection limit of this method was 0.1 μg/kg.[Conclusion]The precision，sensitivity and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of tiamulin and valnemulin in aquatic products.
Key words Dispersive solidphase extractionultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry method （UPLCMS/MS）;Aquatic products;Tiamulin;Valnemulin
20世50年代，学者从高等真菌Pleurotus multilus（Fr.）Sacc.和P.passecke-rianus Pilat中提取截短侧耳素，这是具有抗菌活性的双萜类化合物，它包括一个含有8个手性碳原子的5-6-8三元环骨架和一个乙醇酸酯侧链[1]。泰妙菌素、沃尼妙林是经过化学修饰后，具有很强抗耐药菌活性的截短侧耳素类药物，最早用于防治革兰氏阳性细菌、支原体等疾病的。泰妙菌素和沃尼妙林具有抗菌谱广、毒性小等特点，对生殖支原体、猪密螺旋体以及水产品都有良好的抗菌性[2]。研究表明，少量使用泰妙菌素和沃尼妙林，能够促进水产品的生长，减少病虫害的危害。但是在实际生产养殖过程中，存在着滥用泰妙菌素和沃尼妙林的现象，大量地使用泰妙菌素和沃尼妙林会使水产品体内蓄积并导致无法完全代谢，最终通过水产品消费进入人体并带来潜在危害[3-5]。我国农业部235公告中对猪、兔、鸡中泰妙菌素的残留作出了严格的规定，但对水产品中的泰妙菌素和沃尼妙林还未有明确限量规定。因此建立一种方便、有效、准确的检测方法极为重要，以便研究水产品中泰妙菌素和沃尼妙林的给药量和休药期。
目前据已有文献报道，泰妙菌素和沃尼妙林的检测方法主要有气相色谱法（GC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-10]和高效液相色譜-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[11-15]等，超高效液相色谱-串联质谱法拥有超高效液相快速、有效的分离能力和串联质谱的精准灵敏度，是一种快速发展的分析技术[16]。将超高效液相色谱-串联质谱法与国际上通用的分散固相萃取技术[17]相结合，兼具两者的优点，可以真正实现多种兽药残留的快速检测。 笔者使用分散固相萃取技术进行前处理，超高效液相色谱-串联质谱法为检测方法，实现了泰妙菌素和沃尼妙林等兽药残留的快速检测。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准品：泰妙菌素、沃尼妙林（纯度均>98%），美国Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸铵，色谱纯，德国Merck公司;PSA（粒径50 μm）、氨水（分析纯），上海国药集团。 准确称取泰妙菌素和沃尼妙林标准品1 mg，用甲醇溶解定容至50 mL，配成20 μg/mL的中间使用液，于-18 ℃下避光保存待用。
1.2 儀器与设备
ACQUITYTM 超高效液相色谱仪、XEVO TQS三重四极杆质谱仪，美国Waters公司;ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （2.1 mm×50 mm，1.7 μm），美国Waters公司;N-EVAP-112氮吹仪，美国Organomation公司;3-30K 高速冷冻离心机，Sigma公司;MX-S 涡旋搅拌器，美国Scilogex公司。
1.3 UPLC-MS/MS条件
1.3.1 色谱条件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱温30 ℃;进样量5 μL;流动相：A为水溶液（含0.05%甲酸、5 mmol/L乙酸铵），B为乙腈;流速0.25 mL/min;洗脱条件：0～0.5 min，15% B;0.5～1.5 min，15%～65% B;1.5～4.0 min，65% B;4.0～4.5 min，65%～15% B;4.5～5.0 min，15% B。
1.3.2 质谱条件。电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：多反应监测（MRM），正离子模式;毛细管电压3.0 kV;离子源温度120 ℃;脱溶剂气温度350 ℃;干燥气体流速800 L/h;碰撞池压力0.3 Pa。泰妙菌素和沃尼妙林的质谱参数如表1所示。
1.4 样品前处理
1.4.1 提取。取已均质鱼肉1.0 g于50 mL离心管中，加10 mL乙腈超声提取10 min，取出恢复至室温，6 000 r/min离心5 min，全部上清液转移至新的离心管。重复以上操作提取一次，合并后加乙腈至25 mL，待净化。
1.4.2 净化。取乙腈提取液10 mL于预先加有PSA 30 mg的离心管中，涡旋2 min，随后6 000 r/min离心5 min。
1.4.3 浓缩、转溶。吸取5 mL上清液于40 ℃下氮吹，用1.0 mL 流动相A∶B=（ 8.5∶1.5，V∶V）溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，UPLC-MS/MS上机检测分析。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
20 μg/mL的混合标准溶液以10 μL/min 的流速进入离子源，在ESI+离子化模式下进行一级质谱全扫描，对毛细管电压和锥孔电压进行优化，确定泰妙菌素和沃尼妙林的锥孔电压分别为32和12 V。用二级质谱将母离子击碎，选取经碰撞后响应值最高的2个子离子分别为定量离子和定性离子，并调查碰撞能量大小，使母离子与子离子响应值达到最佳响应值。泰妙菌素和沃尼妙林的二级质谱图如图1所示。
2.2 色谱条件的优化 该试验以ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为2种化合物的色谱分析柱，分别选择乙腈-水、甲醇-水、水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵）-乙腈体系以及水溶液（含0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵）-甲醇体系作为流动相，发现乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但乙腈作为有机相时峰形比甲醇好，响应值高，同时在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸铵，改善了被待测物质的峰形，这是由于有机酸和挥发性盐提高了他们的分离度和离子化效率，图2为待测物质的MRM图。
2.3 前处理优化
2.3.1 提取条件的优化。泰妙菌素、沃尼妙林极性偏弱，且易溶于甲醇、乙醇和水等溶剂。试验选取乙腈、丙酮、乙酸乙酯和甲醇4种提取溶剂进行比较，4种溶剂提取效率如图3所示。
试验表明，乙酸乙酯提取，泰妙菌素回收率较好（91.5%），但对沃尼妙林提取回收率较低（83.1%），且部分油脂被萃取到提取液中，对（UPLC-MS/MS） 仪器响应值有明显的抑制作用。乙腈提取2种物质回收率（泰妙菌素88.3%、沃尼妙林86.4%）都高于甲醇和丙酮，且受基质影响较小，故选择乙腈超声10 min，提取2次保证提取率的最大化。
2.3.2 净化条件的选择。
目前，在对泰妙菌素和沃尼妙林报道的已有文献中，多以HLB、C18等SPE净化柱为主，且活化所用磷酸盐缓冲液所造成的酸性环境可能会造成待测药物的损失[18]。该试验以分散固相萃取为前处理方式，对HLB、MAX这2种净化柱和PSA、C18进行对比，净化效果见图4。
结果表明，弱阳离子（HLB、C18）等SPE柱净化回收率一般，弱阴离子（MAX）可能因为对泰妙菌素、沃尼妙林的吸附性能较强，导致回收率降低。PSA能够去除样品中的脂肪酸、糖类物质等不同杂质，对泰妙菌素和沃尼妙林的吸附作用较小，平均回收率高于SPE的方法，并且净化效果明显，故选取PSA比较合适。
2.3.3 吸附剂使用量的优化。
分别将10、20、30、40、50、60、70和80 mg的PSA用于净化试验，比较PSA不同使用量的净化效果，结果表明（图5），当PSA用量为10～20 mg时，目标物质回收率在106.2%～112.3%，分析原因可能是PSA使用量太少，样品中残有脂肪酸和糖类等物质，基质干扰物未除完全，对目标分子产生基质作用。当使用量在30～50 mg，回收率趋于平稳，在80%左右，此时PSA使用量足够吸附杂质，且对目标物质回收率无较大干扰。当PSA使用量继续增大，回收率开始较低，分析原因可能PSA中氨基游离出来，与目标物质中某些基团发生化学反应。综上所述，选择PSA的使用量为30 mg，既保证了净化后样品的纯净，又避免样品在净化过程中过量损失。 2.4 方法学验证
2.4.1 检出限、定量限及线性关系。
取鲫鱼空白样品，按照“1.4”的前处理方法，得到空白基质溶液，配成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的空白基质混合标准工作液，以待测物质的峰面积（y）和相应的浓度（x）绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。根据7个空白样品的基线噪音求其平均值，按3倍信噪比计算其方法检测限（LOD），10倍信噪比计算其方法定量限（LOQ）。2种化合物的线性方程、检出限和定量限见表2。
2.4.2 回收率和精密度。
通过加标回收试验来评价方法的准确性、精密度和回收率。在前处理前，将混合标准溶液加入到1 g草鱼基质中，然后按照“1.4”方法进行前处理。 其中，混合标准工作液分为1.0、2.0、5.0 ng/mL这3个水平，每个平行测定6次。分析结果见表3，测得回收率为82.5%～95.4%，相对标准偏差（RSD）≤9.1%，由此表明该方法重现性、准确性好，精密度、回收率高，能够满足日常检测的要求。
2.5 实际样品检测
用2 mg/L的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液连续药浴60条鲫鱼14 d。利用已建立的方法进行鲫鱼体内泰妙菌素和沃尼妙林残留量的测定，结果发现（图6）鲫鱼的各个组织中均能检测到泰妙菌素和沃尼妙林的残留。表明该研究方法能够同时测定水产品中泰妙菌素和沃尼妙林残留量。
3 结论
该试验采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法建立了同时测定泰妙菌素和沃尼妙林的分析方法，通过仪器条件、提取方式和PSA净化条件的优化，提高试验效率，该方法的检出限为0.1 μg/kg，回收率在82.5% ～95.4%，方法学评价表明该方法具有灵敏度高、准确性好、重现性好、适用性强，而且检出限、定量限以及回收率均能满足水产品质量检测要求的优点，加强了分散固相萃取前处理方式在水产品领域的应用。
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