为了提高褐色双孢蘑菇原生质体产量和再生率,本研究以褐色双孢蘑菇棕秀一号为材料,利用Design-Expert 8.0.6软件进行二次回归分析对褐色双孢蘑菇制备原生质体的条件进行优化。结果表明,原生质体最佳制备条件为溶壁酶1.35%、蜗牛酶7.01%、酶解温度30.4℃、褐色双孢蘑菇菌丝体菌龄8.36 d、酶解时间3.00 h,在此条件下原生质体产量高达4.39×107个·mL-1;当溶壁酶含量为1.32%、蜗牛酶含量为6.96%、褐色双孢蘑菇菌丝体菌龄9.00 d、酶解时间2.97 h、酶解温度31.0℃时,原生质体的再生率最高(15.1%)。利用紫外诱变和化学诱变技术对褐色双孢蘑菇原生质体进行生长特性诱变,筛选获得了18株生长速率提高的突变菌株。本研究为褐色双孢蘑菇在遗传转化、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学研究提供了理论基础。