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摘 要：以黄牛后腿肉为原料，采用传统工艺加工云南牛干巴，分别在腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1 个月、成熟2 个月与成熟3 个月6 个加工阶段取样，应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）技术分析不同加工阶段牛干巴的细菌群落结构及多样性差异。结果表明：牛干巴具有较为丰富的细菌多样性，同时存在明显的优势种群结构变化。腌制阶段的细菌种类最为丰富；腌制前与腌制后的样品中细菌群落结构差异明显，同一阶段细菌群落结构组成类似；存在于牛干巴加工过程中的细菌主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）及明串珠菌属（Leuconostoc）等，其中肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum）是优势菌种；此外，牛干巴加工过程中还存在着不可培养（unculturable bacterium）的菌群。
关键词：云南牛干巴；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳；细菌群落结构；多样性
Analysis of Bacterial Community Structure of Yunnan Dry-Cured Beef by Polymerase Chain
Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophorsis
LIU Shuyun1，2， SHNAG Siqi1，2， SUN Can1， WANG Guiying1，2， CHENG Zhibin2， XIAO Rong1， JIANG Jinxian1，
WANG Shanrong3，*， LIAO Guozhou2，*
（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；
2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province， Kunming 650201， China；
3.Yunnan Rural Leader College， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）
Abstract： Yunnan dry-cured beef was processed from beef hindquarter using the traditional method. Six samples were collected before curing， during the mid- and late-curing stages， and after one， two and three months of fermentation and ripening， respectively and then the bacterial community structure and diversity in dry-cured beef at different processing stages were analyzed using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis （PCR-DGGE）. The results showed that dry-cured beef was relatively rich in bacterial diversity， and the dominant bacterial populations in it were highly diverse. The highest bacterial diversity was found during the curing process of meat； there was a significant difference in the bacterial community structure between cured and uncured meat. The bacterial community structure remained similar at the same stage of processing. The bacterial community mainly consisted of Staphylococcus， Psychrobacter and Leuconostoc， with the predominance of L.mesenteroides subsp. dextranicum， along with unculturable bacteria， during the processing of dry-cured beef.
Key words： Yunnan dry-cured beef； polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis （PCR-DGGE）； bacterial community structure； diversity
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008
中圖分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）09-0044-07 引文格式：
刘姝韵， 尚思奇， 孙灿， 等. 基于PCR-DGGE分析云南牛干巴的细菌群落结构[J]. 肉类研究， 2017， 31（9）： 44-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008. http：//www.rlyj.pub
LIU Shuyun， SHNAG Siqi， SUN Can， et al. Analysis of bacterial community structure of yunnan dry-cured beef by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 44-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008. http：//www.rlyj.pub
云南牛干巴是云南地區一种传统的民族肉制品，它是以黄牛后腿肉为原料，经腌制、晾晒、风干发酵而成的块状自然发酵肉制品[1]。牛干巴制作工艺考究、肉质酥脆、风味独特且营养丰富，但作为一种传统的腌腊肉制品，它在加工过程中主要依靠环境中的微生物生长来进行发酵，产品质量不稳定，其腌制发酵过程会形成复杂的微生物菌群，并产生一些对人体有害的有机化合物，降低了牛干巴的食用安全性[2]。
聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）是研究微生物群落组成及亲缘关系的分子指纹技术，可以高效、直接、快速、全面地分析微生物组成及群落结构，是细菌分类和鉴定的有力工具[3-6]。如今，依赖于培养的微生物分析方法已经无法准确描述完整的菌群结构，具有很大的局限性，而PCR-DGGE技术作为一种免培养方法可以有效避免传统培养方法的不足。虽然该技术在肉品微生物学领域中的应用起步较晚，但近年来其在原料肉和多种肉制品的微生物群落结构分析中得到了广泛的应用，能够对发酵肉制品发酵和成熟过程中的微生物菌群结构多样性及变化进行分析和研究[7-12]。目前，运用不依赖于传统培养的（分子生物学）技术对云南牛干巴微生物方面的研究鲜有报道，已有报道多是采用传统分离培养技术对牛干巴的菌群结构进行研究[1，13-16]。
基于此，本研究采用PCR-DGGE技术对云南牛干巴加工过程中6 个工艺点（腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1 个月、成熟2 个月与成熟3 个月）的微生物变化规律进行系统分析，为进一步了解和认识云南少数民族传统发酵肉制品中微生物的变化规律，改善牛干巴品质，提高其商品价值提供理论基础，促进云南牛干巴产业的持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
检验合格的新鲜黄牛后腿肉（剔除筋膜） 云南省昆明市威远街农贸市场。
食盐 云南盐化股份有限公司；硝酸钠（食品级）、硝酸银、甲醛、冰醋酸、氢氧化钠（均为分析纯或分析纯配制试剂） 国药集团化学试剂有限公司；VC（食品级） 昆明振华制药厂；CTAB环境微生物DNA提取试剂盒、50×TAE Buffer 北京美亿美生物技术有限公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 广州飞扬生物科技有限公司；dNTPs、rTaq、pMD18-T Cloning Kit 宝生物工程（大连）有限公司；DNA纯化试剂盒、DH5α感受态细胞 北京天根生物科技有限公司；引物 南京
金斯瑞生物科技有限公司；40%甲叉双丙烯酰胺（分
析纯） 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；尿素、过硫酸铵（分析纯） 美国Amresco公司；四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）（分析纯） 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
BS11OS精密分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；Centrifuge 5415D离心机 德国Eppendorf股份
公司；T-gradient PCR仪 德国Biometra公司；Gel-Doc 2000凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；JY-SPFT电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；DCode变性梯度凝胶电泳仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牛干巴传统加工工艺
取新鲜黄牛后腿肌肉5 块，于11月份开始腌制，温度在0～l0 ℃之间，腌制15 d左右。具体加工工艺如下：黄牛后腿肉→冷凉→称质量→擦腌制料→入坛压实，密封腌制→晾晒→堆码挤压→风干→成品→切片→包装
腌制料：市售食盐（40 g/kg）、硝酸钠（0.4 g/kg）、VC（0.01 g/kg）。
分别在腌制前（腌制第0天）、腌制中期（腌制第7天）、腌制后期（腌制第15天）、成熟1 个月、成熟2 个月及成熟3 个月6 个工艺点进行取样，每个工艺点取5 个样品。将样品分别编号：腌制前（A）为A1、A2、A3、A4、A5，腌制中期（B）为B1、B2、B3、B4、B5，腌制后期（C）为C1、C2、C3、C4、C5，成熟1 个月（D）为D1、D2、D3、D4、D5，成熟2 个月（E）为E1、E2、E3、E4、E5，成熟3 个月（F）为F1、F2、F3、F4、F5。
用于PCR-DGGE分析的样品：从每个工艺点的5 个牛干巴样品中随机抽取3 个，分别为A1、A3、A4，B1、B3、B4，C1、C3、C4，D1、D3、D4，E1、E3、E4，F1、F3、F4。
1.3.2 样品中总DNA的提取 采用FastDNATM SPIN Kit For Soil试剂盒方法。称取0.5 g样品，按照试剂盒步骤进行样品微生物总DNA的提取，保存于-20 ℃待测。
1.3.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增
参考文献[17]中的方法，以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品的16S rDNA高变区序列。所用引物序列如表1所示。
PCR扩增体系（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、GC-338F（20 μmol/L）1 μL、518R（20 μmol/L）1 μL、模板DNA 50 ng，用dd H2O补至50 μL。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最终72 ℃延伸10 min。
PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit纯化回收，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，Gel-Doc 2000凝胶成像系统拍照。
1.3.4 PCR产物的DGGE分析
取10 μL PCR产物进行DGGE分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中电泳5 h（150 V，60 ℃）。电泳结束后，采用银染法染色，条带显现后立即拍照。
1.3.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序
参考文献[18]中的方法。用灭菌手术刀切下选取的DGGE条带，按试剂盒步骤回收目的条带。将纯化后的DNA片段按1.3.2、1.3.3节中的方法重新进行PCR扩增，随后将DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，与GenBank中的序列进行比对，得出条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3 个克隆进行序列测定。
测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析，下载最相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列，然后采用MEGA软件，Neighbor-Joining法构建系统发育树，自展数为1 000。
1.3.6 细菌多样性指数计算
细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标。根据电泳图谱中样品的条带数目及每个条带的强度（灰度），对各样品的香农指数（H）、均匀度（E）和丰富度（S）等指标进行分析，它们可以用来比较不同样品的微生物多样性[19]。采用Quantity one软件对DGGE图谱中每个样品的电泳条带数目和条带密度进行数字化分析，参考文献[18]中的方法，按照下式计算H和E。
式中：pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率；N为单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度；S为某样品中所有条带数目的总和。
2 结果与分析
2.1 牛干巴细菌组DNA的提取
由图1可知，本研究中的DNA提取方法可以顺利地从牛干巴样品中提取出细菌DNA片段，且所提取的DNA完整性较好，有利于后续的PCR扩增。
2.2 细菌16S rDNA的PCR扩增
由图2可知，以GC-338F和518R为引物扩增细菌DNA的16S rDNA序列，得到的扩增产物大小符合目的片段（200 bp）要求，所有样品的电泳图中均有较亮的扩增条带出现且条带清晰，因此本研究的PCR扩增条件适用于接下来的DGGE电泳分析。
2.3 PCR产物的DGGE分析及主要条带测序
DGGE电泳图谱中条带越多说明样品的生物多样性越丰富，不同位置的条带代表不同种属的细菌；条带的亮度反映了对应细菌的丰度，条带越亮，表明该种细菌的相对含量可能越大，从而反映出微生物的数量和种类[20-21]。
由图3～4可知，不同阶段样品的电泳条带分离效果较好，条带的亮度各有不同，共检测到28 条不同条带，显示出牛干巴中丰富的细菌种类，其中样品A有19 个主要条带，样品B 21个，样品C 18个，样品D 21个，样品E 19个，样品F 20个。
由表2可知，切胶测序的27 个条带中有24 条可以在GenBank中找到与其序列同源性较高（>90%）的种群，根据同源性分析结果，这24 条DGGE条带序列中有10 条属于葡萄球菌属（Staphylococcus），4 条属于未培养细菌（uncultured soil bacterium），3 条属于嗜冷杆菌（Psychrobacter），2 条属于明串珠菌属（Leuconostoc），1 条属于假单胞菌属（Pseudomonas），1 条属于细菌（Bacteria），1 条属于念珠藻屬（Nostoc），1 条属于鞘脂桿菌目（Chitinophagaceae），1 条属于筒胞藻属（Cylindrospermum）。其中条带10与肉明串珠菌（L.carnosum）、条带24与肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum）的序列同源性都达到了100%；牛干巴腌制前样品（A）的最亮条带为21：柱胞鱼腥藻（Anabaena cylindrica PCC 7122），腌制中期样品（B）的最亮条带为16和21，其中条带16为未培养细菌（uncultured bacterium），腌制后期样品（C）的最亮条带为10、13、16和24，其中条带10为肉明串珠菌（L.carnosum），条带13为琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus），条带24为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum），成熟1 个月样品（D）的最亮条带为5、9、13和24，其中条带5为细菌（bacterium SCSIO13196），条带9为马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）；成熟2 个月样品（E）的最亮条带为4、5、16、20、24、27，其中条带4为沙质嗜冷杆菌（Psychrobacter arenosus），条带20为未培养细菌（uncultured bacterium），条带27为近海生嗜冷杆菌（Psychrobacter maritimus）；成熟3 个月样品（F）的最亮条带为2、5、9、10、14、24，其中条带2为草假单胞菌（Pseudomonas poae），条带14为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。 由PCR-DGGE图谱可知，牛干巴样品的整个加工过程均检测出了肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum），由此可以推断，肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum）是牛干巴加工过程中的优势菌种。另外，条带16代表的未培养细菌（uncultured bacterium）也是牛干巴加工过程中的优势菌群，其在牛干巴加工过程中的作用有待进一步研究和验证。
2.4 样品间的微生物相似性分析
由表3可知，整体上看各样品间的DGGE图谱相似性都不高，体现出牛干巴中细菌组成的多样性。依据样品间的相似系数构建聚类分析图，对不同阶段牛干巴样品中细菌群落结构的相似性进行比较。由图5可知，18 个牛干巴样品中的细菌被分成2 类，腌制前与腌制成熟期样品的细菌群落结构差异明显，表明牛干巴样品的细菌组成与腌制、成熟的不同阶段之间存在明显的相关性。
牛干巴腌制前（A）与腌制中期（B）的相似度为75.3%，腌制中期（B）与腌制后期（C）的相似度为64.8%，腌制后期（C）与成熟1 个月（D）的相似度为68.1%，成熟1 个月（D）与成熟2 个月（E）的相似度为67.0%，成熟2 个月（E）与成熟3 个月（F）的相似度为74.2%。从腌制前到成熟3 个月，相邻加工阶段样品间的相似度先下降后上升，其中腌制中期与腌制后期样品间的相似度最低。同一阶段的不同样品间相似度也较低，如腌制前的样品1和样品3之间的相似度仅为55.1%，这说明牛干巴在腌制过程中细菌种类较为丰富。
2.5 牛干巴样品的PCA
由图6可知，主成分因子1（PC1）的贡献率为41.5%，主成分因子2（PC2）的贡献率为16.5%。根据主成分1，B4、C1、D1、D4、E3、F3共6 个样品明显地归于一类，A4、B1、B3、C3、E4归于一类，A1、A3、D3、E1、F1归于一类，而样品C4、F4则离散在圈外，没有明显的类聚，与其他样品差异明显。
2.6 牛干巴样品的微生物多样性
H用来评价微生物群落的多样性，H值越大，说明微生物的种类和数量越多；E表示微生物分布的均匀程度；S表示微生物种类的多寡[22]。由表4可知，随着牛干巴加工过程的进行，成熟2 个月样品的H、E及S值最大，说明此时各样品的微生物种类和数量最多，且分布较均匀。
3 讨 论
通过DGGE图谱可以看出牛干巴样品的细菌组成在腌制前与腌制成熟期有着明显差异，尤其是进入腌制期后，样品间的相似度下降，表明在腌制前期就产生了不同种类的细菌；腌制中期与腌制后期之间的相似度则更低；同一阶段的不同样品间相似度也较低，如腌制前的样品1和样品3之间的相似度仅为55.1%，这说明牛干巴在腌制过程中产生细菌的种类较为丰富，同时也表明牛干巴样品的细菌组成与不同腌制阶段之间存在明显的相关性。
目前关于PCR-DGGE技术应用于肉制品微生物研究的报导较多集中在发酵香肠的微生物区系研究、香肠成熟过程中微生物种群的动态变化研究、主要发酵微生物种类的分离鉴定[23]以及不同地区发酵香肠微生物多样性的差异研究等[24]。应用PCR-DGGE技术对各阶段牛干巴样品中细菌菌落结构进行研究的结果表明，整体来说，牛干巴中细菌多样性较为丰富，优势菌群为葡萄球菌属和明串珠菌属菌，这与陈韵等[25]对贵州侗族酸肉中细菌多样性的研究结果相似。不同时期的牛干巴样品中均检测出了肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum），说明其为牛干巴加工过程中的优势菌种，与孙灿等[1]的研究结果一致。
Cocolin等[26]对意大利发酵香肠菌群分布的研究发现，香肠发酵前葡萄球菌属为优势菌，并且在其成熟过程中有3 种葡萄球菌起主要作用；Silvestri等[27]的研究表明，22 种市售色拉米香肠样品中最常见的为清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌2 种乳酸菌。Fontana等[28-29]采用PCR-DGGE技术研究阿根廷香肠，发现在香肠发酵初期，优势菌群为植物乳杆菌和腐生葡萄球菌。Paleari等[30]发现在用于Bresaola火腿加工的牛肉原料中存在乳酸菌、葡萄球菌和肠细菌，而产品中则主要存在乳酸菌、葡萄球菌属细菌；肖蓉等[16]使用传统分离筛选方法在牛干巴加工过程中筛选到的优势菌为微球菌、乳杆菌、假单胞菌、埃希氏菌和片球菌；刘洋等[31]发现低盐腊肉加工过程中的优势菌是葡萄球菌和乳酸菌，它们的数量较其他菌株高出一个数量级；马晓燕[32]从发酵牛肉加工过程中共筛選出8 株优势细菌，包括5 株葡萄球菌、2 株乳酸菌和1 株芽孢杆菌。以上研究结果均与本研究相似，乳酸菌和葡萄球菌在肉制品中的生长可以使肉中的蛋白质分解为肽和氨基酸，同时产生大量风味物质，提高产品的营养价值。
本研究检测到Uncultured 16、Uncultured 20、Uncultured 22、Uncultured 26非培养细菌，表明利用PCR-DGGE技术得出的结果更加全面、精确。但是由于环境的复杂性、PCR扩增中引物的偏好性、并非DGGE图谱中的所有条带均能成功测序等因素均会影响该技术的准确性，因此针对云南牛干巴加工过程中细菌多样性的变化规律研究还需结合环境因素进行更全面、更深入的分析。
4 结 论
云南牛干巴具有较为丰富的细菌多样性，同时存在明显的优势种群结构变化。牛干巴在腌制阶段的细菌种类最为丰富；18 个牛干巴样品的细菌组成被分成2 类，腌制前与腌制后的样品中细菌群落结构差异明显，同一阶段细菌群落结构组成类似；存在于牛干巴加工过程中的细菌主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）及明串珠菌属（Leuconostoc）等，其中肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）是优势菌种；此外，牛干巴加工过程中还存在着不可培养（uncultured bacterium）的菌群。相较于传统的分离培养法，采用PCR-DGGE技术分析牛干巴中的微生物菌群结构能够得出更加全面和直观的结果，可以为今后进一步改进云南牛干巴的加工工艺、提高其食用安全性提供理论依据。 参考文献：
[1] 孙灿， 肖蓉， 尹丰， 等. 云南牛干巴加工过程产生物胺的微生物消长规律[J]. 肉类研究， 2015， 29（4）： 6-9.
[2] MARCOBAL A， DE LAS RIVAS B， LANDETE J M， et al. Tyramine and phenylethylamine biosynthesis by food bacteria[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2012， 52（5）： 448-467.
DOI：10.1080/10408398.2010.500545.
[3] PENNACCHIA C， ERCOLINI D， VILLANI F. Spoilage-related microbiota associated with chilled beef stored in air or vacuum pack[J]. Food Microbiology， 2011， 28（1）： 84-93. DOI：10.1016/j.fm.2010.08.010.
[4] DING Xiaofei， WU Chongde， HUANG Jun， et al. Eubacterial and archaeal community characteristics in the man-made pit mud revealed by combined PCR-DGGE and FISH analyses[J]. Food Research International， 2014， 62（8）： 1047-1053. DOI：10.1016/j.foofres.2014.05.045.
[5] CHEN Huibin， WANG Meiying， LIN Xiangzhi， et al. Bacterial microbiota profile in gills of modified atmosphere-packaged oysters stored at 4 ℃[J]. Food Microbiology， 2017， 61（1）： 58-65. DOI：10.1016/j.fm.2016.08.006.
[6] EL SHEIKHA A F， MONTET D. How to determine the geographical origin of seafood？[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2016， 56（2）： 306-317. DOI：10.1080/10408398.2012.745478.
[7] COCOLIN L， DOLCI P， RANTSIOU K. Biodiversity and dynamics of meat fermentations： the contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem[J]. Meat Science， 2011， 89（3）： 296-302. DOI：10.1016/j.meatsci.2011.04.011.
[8] 高永超， 王加宁， 迟建国， 等. 污染土壤微生物群落结构分子鉴定技术研究进展[J]. 生物技术， 2012， 22（2）： 91-96. DOI：10.3969/j.issn.1004-311X.2012.02.052.
[9] Lü Xucong， WENG Xiaolan， ZHANG Wen， et al. Microbial diversity of traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine as determined by PCR-mediated DGGE[J]. Food Control， 2012， 28（2）： 426-434. DOI：10.1016/j.foodcont.2012.05.025.
[10] 牛会敏， 魏法山， 袁乾乾. PCR-DGGE技术在肉制品中微生物分析中的应用[J]. 食品安全导刊， 2015（9）： 119-120. DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2015.27.072.
[11] TREMONTE P， SORRENTINO E， PANNELLA G， et al. Detection of different microenvironments and Lactobacillus sakei， biotypes in Ventricina， a traditional fermented sausage from central Italy[J]. International Journal of Food Microbiology， 2017， 242（2）： 132-140. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2016.11.009.
[12] 全拓. 肉制品中主要微生物的检测与研究[D]. 重庆： 西南大学， 2012： 10-12.
[13] 肖蓉， 徐昆龍， 施忠芬， 等. 辐照牛干巴在贮藏过程中微生物变化的研究[J]. 食品工业科技， 2009， 30（1）： 286-288. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2009.01.071.
[14] 胡凯弟， 甘芳瑗， 刘书亮， 等. 不同处理方式对牛干巴贮藏期品质的影响[J]. 食品与发酵工业， 2015， 41（7）： 220-225. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201507041. [15] 徐昆龙， 肖蓉. 腊牛肉加工中微生物消长规律性研究[J]. 中国畜牧兽医文摘， 2005（5）： 73-74. DOI：10.3969/j.issn.1004-7034.2005.04.045.
[16] 肖蓉， 徐昆龙， 刘旭川. 云南黄牛干巴（腊牛肉）中细菌的分离与鉴定[J]. 中国牛业科学， 1998， 24（3）： 21-22.
[17] 赵乾宇. 饲养密度对笼养蛋鸡小肠组织结构和盲肠细菌种群的影响[D]. 大庆： 黑龙江八一农垦大学， 2015： 24.
[18] 郑艳， 姚婷. PCR-DGGE分析甘薯酸浆自然发酵过程中细菌多样性[J]. 食品科学， 2016， 37（7）： 99-103. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607019.
[19] KUANG Y， TANI K， SYNNOTT A J， et al. Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by
culture-independent PCR-DGGE method[J]. Biochemical Engineering Journal， 2009， 45（1）： 76-81. DOI：10.1029/1999JC900266.
[20] 栾同青， 李志军， 钟其顶， 等. 黄酒酿造过程细菌群落结构变化初步研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（12）： 177-180. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.12.055.
[21] ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting： novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods， 2004， 56（3）： 297-314. DOI：10.1016/j.mimet.2003.11.006.
[22] 王建辉， 杨晶， 刘永乐， 等. 基于PCR-DGGE技术对冷藏过程中草鱼肌肉的细菌群落结构分析[J]. 中国食品学报， 2014， 14（9）： 216-223. DOI：10.16429/j.1009-7848.2014.09.035.
[23] RENOUF V， CLAISSE O， MIOT-SERTIER C， et al. Lactic acid bacteria evolution during winemaking： use of rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis[J]. Food Microbiology， 2006， 23（2）： 136-145. DOI：10.1016/j.fm.2005.01.019.
[24] MOROT-BIZOT S C， LEROY S， TALON R. Staphylococcal community of a small unit manufacturing traditional dry fermented sausages[J]. International Journal of Food Microbiology， 2006， 108（2）： 210-217. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2005.12.006.
[25] 陈韵， 胡萍， 湛剑龙， 等. 运用PCR-DGGE技术分析贵州侗族酸肉中细菌多样性[J]. 食品与机械， 2014， 30（2）： 188-191. DOI：10.3969/j.issn.1003-5788.2014.02.047.
[26] COCOLIN L， MANZANO M， AGGIO D， et al. A novel polymerase chain reaction （PCR）-denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） for the identification of Micrococcaceae strains involved in meat fermentations. Its application to naturally fermented Italian sausages[J]. Meat Science， 2001， 58（1）： 59-64. DOI：10.1016/S0309-1740（00）00131-5.
[27] SILVESTRI G， SANTARELLI S， AQUILANTI L， et al. Investigation of the microbial ecology of Ciauscolo， a traditional Italian salami， by culture-dependent techniques and PCR-DGGE[J]. Meat Science， 2007， 77（3）： 413-423. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.04.015.
[28] FONTANA C， VIGNOLO G， COCCONCELLI P S. PCR-DGGE analysis for the identification of microbial populations from Argentinean dry fermented sausages[J]. Journal of Microbiological Methods， 2005， 63（3）： 254-263. DOI：10.1016/j.mimet.2005.03.010.
[29] FONTANA C， SANDRO C P， VIGNOLO G. Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages[J]. International Journal of Food Microbiology， 2005， 103（2）： 131-142. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2004.11.046.
[30] PALEARI M A， MORETTI V M， BERETTA G， et al. Cured products from different animal species[J]. Meat Science， 2003， 63（4）： 485-489. DOI：10.1016/S0309-1740（02）00108-0.
[31] 劉洋， 崔建云， 任发政， 等. 低盐腊肉在加工过程中的菌相变化初探[J]. 食品工业科技， 2005， 26（8）： 49-50. DOI：10.3969/j.issn.1002-0306.2005.08.011.
[32] 马晓燕. 牛肉发酵过程中优势微生物的分离鉴定及应用研究[D]. 保定： 河北农业大学， 2004： 49.
关键词：云南牛干巴；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳；细菌群落结构；多样性
Analysis of Bacterial Community Structure of Yunnan Dry-Cured Beef by Polymerase Chain
Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophorsis
LIU Shuyun1，2， SHNAG Siqi1，2， SUN Can1， WANG Guiying1，2， CHENG Zhibin2， XIAO Rong1， JIANG Jinxian1，
WANG Shanrong3，*， LIAO Guozhou2，*
（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；
2.Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province， Kunming 650201， China；
3.Yunnan Rural Leader College， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）
Abstract： Yunnan dry-cured beef was processed from beef hindquarter using the traditional method. Six samples were collected before curing， during the mid- and late-curing stages， and after one， two and three months of fermentation and ripening， respectively and then the bacterial community structure and diversity in dry-cured beef at different processing stages were analyzed using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis （PCR-DGGE）. The results showed that dry-cured beef was relatively rich in bacterial diversity， and the dominant bacterial populations in it were highly diverse. The highest bacterial diversity was found during the curing process of meat； there was a significant difference in the bacterial community structure between cured and uncured meat. The bacterial community structure remained similar at the same stage of processing. The bacterial community mainly consisted of Staphylococcus， Psychrobacter and Leuconostoc， with the predominance of L.mesenteroides subsp. dextranicum， along with unculturable bacteria， during the processing of dry-cured beef.
Key words： Yunnan dry-cured beef； polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis （PCR-DGGE）； bacterial community structure； diversity
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008
中圖分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）09-0044-07 引文格式：
刘姝韵， 尚思奇， 孙灿， 等. 基于PCR-DGGE分析云南牛干巴的细菌群落结构[J]. 肉类研究， 2017， 31（9）： 44-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008. http：//www.rlyj.pub
LIU Shuyun， SHNAG Siqi， SUN Can， et al. Analysis of bacterial community structure of yunnan dry-cured beef by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 44-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709008. http：//www.rlyj.pub
云南牛干巴是云南地區一种传统的民族肉制品，它是以黄牛后腿肉为原料，经腌制、晾晒、风干发酵而成的块状自然发酵肉制品[1]。牛干巴制作工艺考究、肉质酥脆、风味独特且营养丰富，但作为一种传统的腌腊肉制品，它在加工过程中主要依靠环境中的微生物生长来进行发酵，产品质量不稳定，其腌制发酵过程会形成复杂的微生物菌群，并产生一些对人体有害的有机化合物，降低了牛干巴的食用安全性[2]。
聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）是研究微生物群落组成及亲缘关系的分子指纹技术，可以高效、直接、快速、全面地分析微生物组成及群落结构，是细菌分类和鉴定的有力工具[3-6]。如今，依赖于培养的微生物分析方法已经无法准确描述完整的菌群结构，具有很大的局限性，而PCR-DGGE技术作为一种免培养方法可以有效避免传统培养方法的不足。虽然该技术在肉品微生物学领域中的应用起步较晚，但近年来其在原料肉和多种肉制品的微生物群落结构分析中得到了广泛的应用，能够对发酵肉制品发酵和成熟过程中的微生物菌群结构多样性及变化进行分析和研究[7-12]。目前，运用不依赖于传统培养的（分子生物学）技术对云南牛干巴微生物方面的研究鲜有报道，已有报道多是采用传统分离培养技术对牛干巴的菌群结构进行研究[1，13-16]。
基于此，本研究采用PCR-DGGE技术对云南牛干巴加工过程中6 个工艺点（腌制前、腌制中期、腌制后期、成熟1 个月、成熟2 个月与成熟3 个月）的微生物变化规律进行系统分析，为进一步了解和认识云南少数民族传统发酵肉制品中微生物的变化规律，改善牛干巴品质，提高其商品价值提供理论基础，促进云南牛干巴产业的持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
检验合格的新鲜黄牛后腿肉（剔除筋膜） 云南省昆明市威远街农贸市场。
食盐 云南盐化股份有限公司；硝酸钠（食品级）、硝酸银、甲醛、冰醋酸、氢氧化钠（均为分析纯或分析纯配制试剂） 国药集团化学试剂有限公司；VC（食品级） 昆明振华制药厂；CTAB环境微生物DNA提取试剂盒、50×TAE Buffer 北京美亿美生物技术有限公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit 广州飞扬生物科技有限公司；dNTPs、rTaq、pMD18-T Cloning Kit 宝生物工程（大连）有限公司；DNA纯化试剂盒、DH5α感受态细胞 北京天根生物科技有限公司；引物 南京
金斯瑞生物科技有限公司；40%甲叉双丙烯酰胺（分
析纯） 伯乐生命医学产品（上海）有限公司；尿素、过硫酸铵（分析纯） 美国Amresco公司；四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）（分析纯） 美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
BS11OS精密分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；Centrifuge 5415D离心机 德国Eppendorf股份
公司；T-gradient PCR仪 德国Biometra公司；Gel-Doc 2000凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；JY-SPFT电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司；DCode变性梯度凝胶电泳仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 牛干巴传统加工工艺
取新鲜黄牛后腿肌肉5 块，于11月份开始腌制，温度在0～l0 ℃之间，腌制15 d左右。具体加工工艺如下：黄牛后腿肉→冷凉→称质量→擦腌制料→入坛压实，密封腌制→晾晒→堆码挤压→风干→成品→切片→包装
腌制料：市售食盐（40 g/kg）、硝酸钠（0.4 g/kg）、VC（0.01 g/kg）。
分别在腌制前（腌制第0天）、腌制中期（腌制第7天）、腌制后期（腌制第15天）、成熟1 个月、成熟2 个月及成熟3 个月6 个工艺点进行取样，每个工艺点取5 个样品。将样品分别编号：腌制前（A）为A1、A2、A3、A4、A5，腌制中期（B）为B1、B2、B3、B4、B5，腌制后期（C）为C1、C2、C3、C4、C5，成熟1 个月（D）为D1、D2、D3、D4、D5，成熟2 个月（E）为E1、E2、E3、E4、E5，成熟3 个月（F）为F1、F2、F3、F4、F5。
用于PCR-DGGE分析的样品：从每个工艺点的5 个牛干巴样品中随机抽取3 个，分别为A1、A3、A4，B1、B3、B4，C1、C3、C4，D1、D3、D4，E1、E3、E4，F1、F3、F4。
1.3.2 样品中总DNA的提取 采用FastDNATM SPIN Kit For Soil试剂盒方法。称取0.5 g样品，按照试剂盒步骤进行样品微生物总DNA的提取，保存于-20 ℃待测。
1.3.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增
参考文献[17]中的方法，以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品的16S rDNA高变区序列。所用引物序列如表1所示。
PCR扩增体系（50 μL）：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、GC-338F（20 μmol/L）1 μL、518R（20 μmol/L）1 μL、模板DNA 50 ng，用dd H2O补至50 μL。
PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最终72 ℃延伸10 min。
PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit纯化回收，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，Gel-Doc 2000凝胶成像系统拍照。
1.3.4 PCR产物的DGGE分析
取10 μL PCR产物进行DGGE分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中电泳5 h（150 V，60 ℃）。电泳结束后，采用银染法染色，条带显现后立即拍照。
1.3.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序
参考文献[18]中的方法。用灭菌手术刀切下选取的DGGE条带，按试剂盒步骤回收目的条带。将纯化后的DNA片段按1.3.2、1.3.3节中的方法重新进行PCR扩增，随后将DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，与GenBank中的序列进行比对，得出条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3 个克隆进行序列测定。
测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析，下载最相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列，然后采用MEGA软件，Neighbor-Joining法构建系统发育树，自展数为1 000。
1.3.6 细菌多样性指数计算
细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标。根据电泳图谱中样品的条带数目及每个条带的强度（灰度），对各样品的香农指数（H）、均匀度（E）和丰富度（S）等指标进行分析，它们可以用来比较不同样品的微生物多样性[19]。采用Quantity one软件对DGGE图谱中每个样品的电泳条带数目和条带密度进行数字化分析，参考文献[18]中的方法，按照下式计算H和E。
式中：pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率；N为单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度；S为某样品中所有条带数目的总和。
2 结果与分析
2.1 牛干巴细菌组DNA的提取
由图1可知，本研究中的DNA提取方法可以顺利地从牛干巴样品中提取出细菌DNA片段，且所提取的DNA完整性较好，有利于后续的PCR扩增。
2.2 细菌16S rDNA的PCR扩增
由图2可知，以GC-338F和518R为引物扩增细菌DNA的16S rDNA序列，得到的扩增产物大小符合目的片段（200 bp）要求，所有样品的电泳图中均有较亮的扩增条带出现且条带清晰，因此本研究的PCR扩增条件适用于接下来的DGGE电泳分析。
2.3 PCR产物的DGGE分析及主要条带测序
DGGE电泳图谱中条带越多说明样品的生物多样性越丰富，不同位置的条带代表不同种属的细菌；条带的亮度反映了对应细菌的丰度，条带越亮，表明该种细菌的相对含量可能越大，从而反映出微生物的数量和种类[20-21]。
由图3～4可知，不同阶段样品的电泳条带分离效果较好，条带的亮度各有不同，共检测到28 条不同条带，显示出牛干巴中丰富的细菌种类，其中样品A有19 个主要条带，样品B 21个，样品C 18个，样品D 21个，样品E 19个，样品F 20个。
由表2可知，切胶测序的27 个条带中有24 条可以在GenBank中找到与其序列同源性较高（>90%）的种群，根据同源性分析结果，这24 条DGGE条带序列中有10 条属于葡萄球菌属（Staphylococcus），4 条属于未培养细菌（uncultured soil bacterium），3 条属于嗜冷杆菌（Psychrobacter），2 条属于明串珠菌属（Leuconostoc），1 条属于假单胞菌属（Pseudomonas），1 条属于细菌（Bacteria），1 条属于念珠藻屬（Nostoc），1 条属于鞘脂桿菌目（Chitinophagaceae），1 条属于筒胞藻属（Cylindrospermum）。其中条带10与肉明串珠菌（L.carnosum）、条带24与肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum）的序列同源性都达到了100%；牛干巴腌制前样品（A）的最亮条带为21：柱胞鱼腥藻（Anabaena cylindrica PCC 7122），腌制中期样品（B）的最亮条带为16和21，其中条带16为未培养细菌（uncultured bacterium），腌制后期样品（C）的最亮条带为10、13、16和24，其中条带10为肉明串珠菌（L.carnosum），条带13为琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus），条带24为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum），成熟1 个月样品（D）的最亮条带为5、9、13和24，其中条带5为细菌（bacterium SCSIO13196），条带9为马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）；成熟2 个月样品（E）的最亮条带为4、5、16、20、24、27，其中条带4为沙质嗜冷杆菌（Psychrobacter arenosus），条带20为未培养细菌（uncultured bacterium），条带27为近海生嗜冷杆菌（Psychrobacter maritimus）；成熟3 个月样品（F）的最亮条带为2、5、9、10、14、24，其中条带2为草假单胞菌（Pseudomonas poae），条带14为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。 由PCR-DGGE图谱可知，牛干巴样品的整个加工过程均检测出了肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum），由此可以推断，肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp. dextranicum）是牛干巴加工过程中的优势菌种。另外，条带16代表的未培养细菌（uncultured bacterium）也是牛干巴加工过程中的优势菌群，其在牛干巴加工过程中的作用有待进一步研究和验证。
2.4 样品间的微生物相似性分析
由表3可知，整体上看各样品间的DGGE图谱相似性都不高，体现出牛干巴中细菌组成的多样性。依据样品间的相似系数构建聚类分析图，对不同阶段牛干巴样品中细菌群落结构的相似性进行比较。由图5可知，18 个牛干巴样品中的细菌被分成2 类，腌制前与腌制成熟期样品的细菌群落结构差异明显，表明牛干巴样品的细菌组成与腌制、成熟的不同阶段之间存在明显的相关性。
牛干巴腌制前（A）与腌制中期（B）的相似度为75.3%，腌制中期（B）与腌制后期（C）的相似度为64.8%，腌制后期（C）与成熟1 个月（D）的相似度为68.1%，成熟1 个月（D）与成熟2 个月（E）的相似度为67.0%，成熟2 个月（E）与成熟3 个月（F）的相似度为74.2%。从腌制前到成熟3 个月，相邻加工阶段样品间的相似度先下降后上升，其中腌制中期与腌制后期样品间的相似度最低。同一阶段的不同样品间相似度也较低，如腌制前的样品1和样品3之间的相似度仅为55.1%，这说明牛干巴在腌制过程中细菌种类较为丰富。
2.5 牛干巴样品的PCA
由图6可知，主成分因子1（PC1）的贡献率为41.5%，主成分因子2（PC2）的贡献率为16.5%。根据主成分1，B4、C1、D1、D4、E3、F3共6 个样品明显地归于一类，A4、B1、B3、C3、E4归于一类，A1、A3、D3、E1、F1归于一类，而样品C4、F4则离散在圈外，没有明显的类聚，与其他样品差异明显。
2.6 牛干巴样品的微生物多样性
H用来评价微生物群落的多样性，H值越大，说明微生物的种类和数量越多；E表示微生物分布的均匀程度；S表示微生物种类的多寡[22]。由表4可知，随着牛干巴加工过程的进行，成熟2 个月样品的H、E及S值最大，说明此时各样品的微生物种类和数量最多，且分布较均匀。
3 讨 论
通过DGGE图谱可以看出牛干巴样品的细菌组成在腌制前与腌制成熟期有着明显差异，尤其是进入腌制期后，样品间的相似度下降，表明在腌制前期就产生了不同种类的细菌；腌制中期与腌制后期之间的相似度则更低；同一阶段的不同样品间相似度也较低，如腌制前的样品1和样品3之间的相似度仅为55.1%，这说明牛干巴在腌制过程中产生细菌的种类较为丰富，同时也表明牛干巴样品的细菌组成与不同腌制阶段之间存在明显的相关性。
目前关于PCR-DGGE技术应用于肉制品微生物研究的报导较多集中在发酵香肠的微生物区系研究、香肠成熟过程中微生物种群的动态变化研究、主要发酵微生物种类的分离鉴定[23]以及不同地区发酵香肠微生物多样性的差异研究等[24]。应用PCR-DGGE技术对各阶段牛干巴样品中细菌菌落结构进行研究的结果表明，整体来说，牛干巴中细菌多样性较为丰富，优势菌群为葡萄球菌属和明串珠菌属菌，这与陈韵等[25]对贵州侗族酸肉中细菌多样性的研究结果相似。不同时期的牛干巴样品中均检测出了肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum），说明其为牛干巴加工过程中的优势菌种，与孙灿等[1]的研究结果一致。
Cocolin等[26]对意大利发酵香肠菌群分布的研究发现，香肠发酵前葡萄球菌属为优势菌，并且在其成熟过程中有3 种葡萄球菌起主要作用；Silvestri等[27]的研究表明，22 种市售色拉米香肠样品中最常见的为清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌2 种乳酸菌。Fontana等[28-29]采用PCR-DGGE技术研究阿根廷香肠，发现在香肠发酵初期，优势菌群为植物乳杆菌和腐生葡萄球菌。Paleari等[30]发现在用于Bresaola火腿加工的牛肉原料中存在乳酸菌、葡萄球菌和肠细菌，而产品中则主要存在乳酸菌、葡萄球菌属细菌；肖蓉等[16]使用传统分离筛选方法在牛干巴加工过程中筛选到的优势菌为微球菌、乳杆菌、假单胞菌、埃希氏菌和片球菌；刘洋等[31]发现低盐腊肉加工过程中的优势菌是葡萄球菌和乳酸菌，它们的数量较其他菌株高出一个数量级；马晓燕[32]从发酵牛肉加工过程中共筛選出8 株优势细菌，包括5 株葡萄球菌、2 株乳酸菌和1 株芽孢杆菌。以上研究结果均与本研究相似，乳酸菌和葡萄球菌在肉制品中的生长可以使肉中的蛋白质分解为肽和氨基酸，同时产生大量风味物质，提高产品的营养价值。
本研究检测到Uncultured 16、Uncultured 20、Uncultured 22、Uncultured 26非培养细菌，表明利用PCR-DGGE技术得出的结果更加全面、精确。但是由于环境的复杂性、PCR扩增中引物的偏好性、并非DGGE图谱中的所有条带均能成功测序等因素均会影响该技术的准确性，因此针对云南牛干巴加工过程中细菌多样性的变化规律研究还需结合环境因素进行更全面、更深入的分析。
4 结 论
云南牛干巴具有较为丰富的细菌多样性，同时存在明显的优势种群结构变化。牛干巴在腌制阶段的细菌种类最为丰富；18 个牛干巴样品的细菌组成被分成2 类，腌制前与腌制后的样品中细菌群落结构差异明显，同一阶段细菌群落结构组成类似；存在于牛干巴加工过程中的细菌主要为葡萄球菌属（Staphylococcus）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）及明串珠菌属（Leuconostoc）等，其中肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）是优势菌种；此外，牛干巴加工过程中还存在着不可培养（uncultured bacterium）的菌群。相较于传统的分离培养法，采用PCR-DGGE技术分析牛干巴中的微生物菌群结构能够得出更加全面和直观的结果，可以为今后进一步改进云南牛干巴的加工工艺、提高其食用安全性提供理论依据。 参考文献：
[1] 孙灿， 肖蓉， 尹丰， 等. 云南牛干巴加工过程产生物胺的微生物消长规律[J]. 肉类研究， 2015， 29（4）： 6-9.
[2] MARCOBAL A， DE LAS RIVAS B， LANDETE J M， et al. Tyramine and phenylethylamine biosynthesis by food bacteria[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2012， 52（5）： 448-467.
DOI：10.1080/10408398.2010.500545.
[3] PENNACCHIA C， ERCOLINI D， VILLANI F. Spoilage-related microbiota associated with chilled beef stored in air or vacuum pack[J]. Food Microbiology， 2011， 28（1）： 84-93. DOI：10.1016/j.fm.2010.08.010.
[4] DING Xiaofei， WU Chongde， HUANG Jun， et al. Eubacterial and archaeal community characteristics in the man-made pit mud revealed by combined PCR-DGGE and FISH analyses[J]. Food Research International， 2014， 62（8）： 1047-1053. DOI：10.1016/j.foofres.2014.05.045.
[5] CHEN Huibin， WANG Meiying， LIN Xiangzhi， et al. Bacterial microbiota profile in gills of modified atmosphere-packaged oysters stored at 4 ℃[J]. Food Microbiology， 2017， 61（1）： 58-65. DOI：10.1016/j.fm.2016.08.006.
[6] EL SHEIKHA A F， MONTET D. How to determine the geographical origin of seafood？[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2016， 56（2）： 306-317. DOI：10.1080/10408398.2012.745478.
[7] COCOLIN L， DOLCI P， RANTSIOU K. Biodiversity and dynamics of meat fermentations： the contribution of molecular methods for a better comprehension of a complex ecosystem[J]. Meat Science， 2011， 89（3）： 296-302. DOI：10.1016/j.meatsci.2011.04.011.
[8] 高永超， 王加宁， 迟建国， 等. 污染土壤微生物群落结构分子鉴定技术研究进展[J]. 生物技术， 2012， 22（2）： 91-96. DOI：10.3969/j.issn.1004-311X.2012.02.052.
[9] Lü Xucong， WENG Xiaolan， ZHANG Wen， et al. Microbial diversity of traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine as determined by PCR-mediated DGGE[J]. Food Control， 2012， 28（2）： 426-434. DOI：10.1016/j.foodcont.2012.05.025.
[10] 牛会敏， 魏法山， 袁乾乾. PCR-DGGE技术在肉制品中微生物分析中的应用[J]. 食品安全导刊， 2015（9）： 119-120. DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2015.27.072.
[11] TREMONTE P， SORRENTINO E， PANNELLA G， et al. Detection of different microenvironments and Lactobacillus sakei， biotypes in Ventricina， a traditional fermented sausage from central Italy[J]. International Journal of Food Microbiology， 2017， 242（2）： 132-140. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2016.11.009.
[12] 全拓. 肉制品中主要微生物的检测与研究[D]. 重庆： 西南大学， 2012： 10-12.
[13] 肖蓉， 徐昆龍， 施忠芬， 等. 辐照牛干巴在贮藏过程中微生物变化的研究[J]. 食品工业科技， 2009， 30（1）： 286-288. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2009.01.071.
[14] 胡凯弟， 甘芳瑗， 刘书亮， 等. 不同处理方式对牛干巴贮藏期品质的影响[J]. 食品与发酵工业， 2015， 41（7）： 220-225. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201507041. [15] 徐昆龙， 肖蓉. 腊牛肉加工中微生物消长规律性研究[J]. 中国畜牧兽医文摘， 2005（5）： 73-74. DOI：10.3969/j.issn.1004-7034.2005.04.045.
[16] 肖蓉， 徐昆龙， 刘旭川. 云南黄牛干巴（腊牛肉）中细菌的分离与鉴定[J]. 中国牛业科学， 1998， 24（3）： 21-22.
[17] 赵乾宇. 饲养密度对笼养蛋鸡小肠组织结构和盲肠细菌种群的影响[D]. 大庆： 黑龙江八一农垦大学， 2015： 24.
[18] 郑艳， 姚婷. PCR-DGGE分析甘薯酸浆自然发酵过程中细菌多样性[J]. 食品科学， 2016， 37（7）： 99-103. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607019.
[19] KUANG Y， TANI K， SYNNOTT A J， et al. Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by
culture-independent PCR-DGGE method[J]. Biochemical Engineering Journal， 2009， 45（1）： 76-81. DOI：10.1029/1999JC900266.
[20] 栾同青， 李志军， 钟其顶， 等. 黄酒酿造过程细菌群落结构变化初步研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（12）： 177-180. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.12.055.
[21] ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting： novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods， 2004， 56（3）： 297-314. DOI：10.1016/j.mimet.2003.11.006.
[22] 王建辉， 杨晶， 刘永乐， 等. 基于PCR-DGGE技术对冷藏过程中草鱼肌肉的细菌群落结构分析[J]. 中国食品学报， 2014， 14（9）： 216-223. DOI：10.16429/j.1009-7848.2014.09.035.
[23] RENOUF V， CLAISSE O， MIOT-SERTIER C， et al. Lactic acid bacteria evolution during winemaking： use of rpoB gene as a target for PCR-DGGE analysis[J]. Food Microbiology， 2006， 23（2）： 136-145. DOI：10.1016/j.fm.2005.01.019.
[24] MOROT-BIZOT S C， LEROY S， TALON R. Staphylococcal community of a small unit manufacturing traditional dry fermented sausages[J]. International Journal of Food Microbiology， 2006， 108（2）： 210-217. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2005.12.006.
[25] 陈韵， 胡萍， 湛剑龙， 等. 运用PCR-DGGE技术分析贵州侗族酸肉中细菌多样性[J]. 食品与机械， 2014， 30（2）： 188-191. DOI：10.3969/j.issn.1003-5788.2014.02.047.
[26] COCOLIN L， MANZANO M， AGGIO D， et al. A novel polymerase chain reaction （PCR）-denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE） for the identification of Micrococcaceae strains involved in meat fermentations. Its application to naturally fermented Italian sausages[J]. Meat Science， 2001， 58（1）： 59-64. DOI：10.1016/S0309-1740（00）00131-5.
[27] SILVESTRI G， SANTARELLI S， AQUILANTI L， et al. Investigation of the microbial ecology of Ciauscolo， a traditional Italian salami， by culture-dependent techniques and PCR-DGGE[J]. Meat Science， 2007， 77（3）： 413-423. DOI：10.1016/j.meatsci.2007.04.015.
[28] FONTANA C， VIGNOLO G， COCCONCELLI P S. PCR-DGGE analysis for the identification of microbial populations from Argentinean dry fermented sausages[J]. Journal of Microbiological Methods， 2005， 63（3）： 254-263. DOI：10.1016/j.mimet.2005.03.010.
[29] FONTANA C， SANDRO C P， VIGNOLO G. Monitoring the bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean sausages[J]. International Journal of Food Microbiology， 2005， 103（2）： 131-142. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2004.11.046.
[30] PALEARI M A， MORETTI V M， BERETTA G， et al. Cured products from different animal species[J]. Meat Science， 2003， 63（4）： 485-489. DOI：10.1016/S0309-1740（02）00108-0.
[31] 劉洋， 崔建云， 任发政， 等. 低盐腊肉在加工过程中的菌相变化初探[J]. 食品工业科技， 2005， 26（8）： 49-50. DOI：10.3969/j.issn.1002-0306.2005.08.011.
[32] 马晓燕. 牛肉发酵过程中优势微生物的分离鉴定及应用研究[D]. 保定： 河北农业大学， 2004： 49.