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【摘要】 目的:比较IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2的一致性。方法:分别用IHC和FISH对118例乳腺浸润性导管癌HER-2进行检测,比较两者检测结果的相关性。结果:118例浸润性乳腺导管癌标本,IHC检测结果为:14例为(-);20例为(1+),55例为(2+),29例为(3+)。FISH检测结果为:53例为>2.2,64例为<1.8,1例为1.8-2.2。IHC检测HER-2阳性的病例FISH检测中阳性符合率96.6%(28/29),IHC检测HER-2阴性的病例FISH检测均为阴性,符合率100%(34/34)。IHC检测HER-2(2+)的55例患者中有25例经FISH检测证实HER-2阳性,30例呈阴性。FISH检测共发现5例17号染色体多体,其发生率为4.24%。IHC检测到8例乳腺癌HER-2表达存在异质性,异质性在FISH检测中亦得到证实。结论:IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2具有高度一致性,免疫组化HER-2(2+)病例需行FISH检测。
【关键词】 浸润性导管癌; HER-2; 免疫组织化学; 荧光原位杂交
【Abstract】 Objective:To compare the consistency of HER-2 in breast infiltrating ductal carcinoma by IHC and FISH detection.Method:HER-2 of 118 cases with breast invasive ductal carcinoma were tested by FISH and IHC detection,and compared the results correlation.Result:118 specimens of invasive ductal carcinoma were seleced, The results tested by IHC were as follows:14 cases(-);20 cases(1+),55 cases(2+),29 cases (3+).The results tested by FISH were as follows: 53 cases >2.2, 64 cases <1.8,1 case was 1.8-2.2.HER-2 positive coincidence rate was 96.6%(28/29) by IHC detection in positive cases by FISH detection,HER-2 negative by FISH were in negative of IHC detection, the coincidence rate was 100%(34/34).25 HER-2 positive cases by FISH detection were among 55 cases of HER-2(2+) by IHC detection, and 30 were the negative.5 cases on chromosome multi-body in 17 were found by FISH detection,its incidence rate was 4.24%.HER-2 expression in 8 cases with of breast cancer exists heterogeneity by IHC detection,and the heterogeneity was also confirmed in FISH detected.Conclusion:HER-2 of breast infiltrating ductal carcinoma by IHC detection was high consistency with FISH detection,HER-2 cases(2+) by immunohistochemical need to be detected by FISH.
【Key words】 Infiltrating ductal carcinoma; HER-2; Immunohistochemistry; Fluorescence in situ hybridization
正确检测和评定乳腺癌的HER-2蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要,HER-2检测结果不仅涉及患者的预后评估,而且是筛选是否适合针对HER2的靶向治疗的先决条件,并且可以对内分泌治疗、化疗方案的选择起到指导作用[1]。近年,乳腺癌组织中HER-2状态检测的应用技术越来越多。大致分为:(1)基于HER-2蛋白水平的检测,如免疫组织化学(IHC)。(2)基于HER-2基因DNA水平的检测,如荧光原位杂交(FISH)。本文收集本科行IHC检测及FISH的乳腺浸润性导管癌病例118例,比较IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2的一致性,现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2013年11月-2014年10月本科行IHC检测及FISH的乳腺浸润性导管癌病例,共118例。均为女性,其中穿刺标本12例,切除标本106例。
1.2 方法 HER-2基因扩增检测试剂盒购于广州安必平公司。免疫组化HER-2/neu多克隆抗体购自福州迈新。
1.3 检测结果判定标准 参照《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》[2]对检测结果进行判定,并由本院2名经专业培训的病理医师进行判读。
1.3.1 IHC检测HER-2的判定方法 对乳腺浸润性癌的癌细胞膜进行定位后染色。(1)阴性:存在≤10%的不完整细胞膜染色,或者无浸润性癌细胞的染色,则记为(-);(2)弱阳性:>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色,记为(1+);(3)可疑阳性:有两种情况,第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和/或弱至中等强度的细胞膜染色,第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色,记为(2+);(4)强阳性:>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色,记为(3+)[3]。 1.3.2 FISH检测HER-2的判定方法 首先对HE染色切片中的癌细胞区域进行确定,并选择出满意的杂交信号区域,采用100倍油镜经特意性单通道滤光片对癌细胞核中FISH结果进行观察,并进行cutoff值和信号计数的计算。按照试剂说明书的要求,记录60 个相连续的癌细胞核中的双色信号:(1)如红色、绿色两种信号的比值大于2.2,或者众多信号间连接成团时,则不用计数,可归入基因扩增;(2)如两信号的比值处于1.8-2.2之间,则重新再计数60个相连续的癌细胞。若结果同前,则在FISH的检测报告中注释;(3)如红色、绿色两信号间比值小于1.8,不存在HER-2基因的扩增;如不同癌细胞中的HER-2基因扩增现象具有异质性,则需要另选癌区及计数,并注明在检测报告中[4]。
1.4 统计学处理 本研究中数据的收集与处理均由本院数据处理中心专门人员进行,以保证数据真实性与科学性。初步数据录入EXCEL(2003版)进行逻辑校对与分析;并应用SPSS 22.0对资料进行一般描述,计数资料用(%)表示,采用 字2检验;并进行IHC及FISH一致性检验,计算kappa值和P值,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IHC及FISH检测结果 IHC检测结果为:(-)病例比例为11.86%;(1+)病例占16.95%,(2+)病例占46.61%,(3+)病例占24.58%。FISH检测结果为:53例为比值>2.2,64例比值<1.8,1例比值为1.8-2.2。见表1。
2.2 本组118例病例中HER-2在伴或不伴17号染色体患者中的基因分状态分布状况分析 IHC检测到8例乳腺癌HER-2表达存在异质性,其发生率为6.78%,异质性在FISH中亦得到证实。FISH检测共发现5例17号染色体多体,其发生率为4.24%,均为IHC(3+)病例。见表2。
2.3 IHC及FISH检测一致性分析 IHC阳性病例29例,FISH检测比值>2.2有28例,1例为1.8-2.2;IHC阴性病例34例,FISH检测比值均为<1.8。免疫组化阳性病例及阴性病例与FISH符合率为98.41%(62/63),kappa值为0.968,P=0.000,具有高度一致性。
3 讨论
HER-2是人类17q21染色体上的基因。该基因的表达不仅和肿瘤的发生、发展相关,更是临床预后评估的重要指标[5]。乳腺癌组织中HER-2状态检测的应用技术越来越多,关于基于HER-2蛋白水平的检测,与基因HERR-2的DNA水平的检测相比,哪种方法更为准确可靠,大多数学者的争论甚多,而争论的焦点在于对17号染色体的多体性的认识[6]。目前研究显示整条17号染色体的多体罕见,CEPl7的多体并不能代表整条第17号染色体多体,部分乳腺癌中17号染色体存在HER-2基因和着丝粒的共同扩增[7]。越来越多的学者认为,HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要[8]。因此,美国ASCO/CAP 2013版HER-2检测指南及我国《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》[2]均强调质量控制,同时推荐了IHC及ISH(in situ hybridization,原位杂交)两种方法。
研究资料显示,IHC检测为-、1+、2+、3+中FISH的符合率分别分:100%、100%、45.45%、96.55%;同时在本研究的118例病例中,IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2的结果具有高度一致性。与Viale等学者的研究结果相似[9]。IHC是一项广泛而实用的技术,具有检测成本低、操作简单、耗时短、可实现自动化检测和染色后切片便于存档等优点,阅片时可同时进行组织形态学评价,因此,成为乳腺癌患者检测HER-2扩增最常使用的方法[10]。但IHC是一种半定量的方法,结果判定的标准为描述性语言,判读的主观影响较大,未经严格培训的医师判定一致性偏低,较多的病例归入不确定病例[11-12]。尽管ISH成本较贵,但具有高度的稳定性及重复性,尤其是双探针FISH加入了17号染色体着丝粒探针作为内对照。乳腺癌中常见17号染色体的多体现象,在CEP17中平均每个细胞中都至少3个。相关研究显示,17号染色体的多体会增加浸润导管癌中HER-2基因的拷贝数,从而导致了HER-2基因蛋白的过表达,最终造成了IHC检测假阳性结果[13]。FISH的结果判定更为客观,主观影响很小,经培训的医师间判定的一致性极高,已成为HER-2检测的“金标准”[14],可作为IHC的有益的补充。经阅读相关文献并结合本研究实践后,我们认为免疫组化法检测为(3+)的病例中,IHC和FISH具有较高一致性,可作为诊断的直接依据;而对于诊断为(-)和(1+)的病例而言,IHC结果为阴性者,可选择性予以FISH检测;但检测结果为(2+)的患者,由于两种检测方法的一致性较一般,因此需重点对患者予以FISH检测[15-16]。
综上所述,对于IHC 2+的病例,建议行FISH检测。对于大多数IHC 2+的病例,FISH均能明确HER-2状态,当然,对于FISH无法确定HER-2状态的标本,应积极选择其他方法(如PCR、RNA-ISH等)进行检测。
参考文献
[1]赵伟志,叶晓霞.乳腺浸润性微乳头状癌临床病理学观察及免疫组化分析[J].中国医学创新,2014,3(19):40-43.
[2]《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》编写组.乳腺癌HER2检测指南(2014版)[J]. 中华病理学杂志,2014,43(4):262-267.
[3] Susini T,Bussani C,Marini,et al.Preoperative assessment of HER-2/neu status in breast carcinoma: the role of quantitative real-time PCR on core-biopsy specimens[J].Gynecologic Oncology,2010,116(2):234-239. [4]谭敏华,雷伟华,谭冬玲,等.浸润性乳腺癌ER、PR、HER-2、E-cadherin、CK5/6检测与临床预后关系[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(9):933-938.
[5]赵坡,姜学革,李晓瑛,等.FISH检测乳腺癌HER-2基因扩增及17号染色体多体状况及其临床病理学意义的分析[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(9):680-683.
[6]王立波,王彦荣,席妍,等.mTOR在HER-2阴性乳腺癌中的表达及意义[J].中国实验诊断学,2014,19(8):1262-1264.
[7] Goud K I,Dayakar S,Vijayalaxmi K,et al.Evaluation of HER-2/neu status in breast cancer specimens using immunohistochemistry (IHC) &;fluorescence in-situ hybridization (FISH) assay[J].The Indian journal of medical research,2012,135(3):312-317.
[8]张江宇,王颀,郜红艺,等.IHC和FISH检测乳腺癌HER-2表达的对比研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(6):436-439.
[9] Poonam Panjwani,Sridhar Epari,Arti Karpate,et al.Assessment of HER-2/neu status in breast cancer using fluorescence in situ hybridization &;immunohistochemistry:Experience of a tertiary cancer referral centre in India[J].The Indian Journal of Medical Research,2010,132(3):287-294.
[10]舒文环,仲伟霞.乳腺癌原发灶与转移灶HR和HER-2一致性的研究现状[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(9):734-736.
[11]刘琪,左文述,王新昭,等.乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶激素受体及HER-2与Ki-67表达相关性分析[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(15):1153-1157.
[12]曹丹霞,何建蓉,沈坤炜,等.激素受体和HER-2及Ki-67预测乳腺癌新辅助化疗疗效价值的分析[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(13):1000-1003.
[13] Han Zhang,Guoping Ren,Xiaoling Wang,et al.HER-2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization(FISH) compared with immunohistochemistry (IHC) in breast cancer:a study of 528 equivocal cases.[J].Breast Cancer Research and Treatment,2012,134(2):743-749.
[14]吕海军,李峰,吴明霞,等.PCR分析FISH与IHC检测人乳腺癌组织中HER-2表达的差异性[J].中国保健营养(中旬刊),2013,15(5):51-52.
[15]张青,李小欢,杨真,等.110例乳腺癌患者HER-2基因扩增状况及其与临床病理特征的关系[J].中国医药导报,2013,10(11):86-88.
[16] Al Khattabi H,Kelany A,Buhmeida A,et al.Evaluation of HER-2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry in saudi female breast cancer[J].Anticancer Research,2010,30(10):4081-4088.
(收稿日期:2014-11-07) (本文编辑:陈丹云)
【关键词】 浸润性导管癌; HER-2; 免疫组织化学; 荧光原位杂交
【Abstract】 Objective:To compare the consistency of HER-2 in breast infiltrating ductal carcinoma by IHC and FISH detection.Method:HER-2 of 118 cases with breast invasive ductal carcinoma were tested by FISH and IHC detection,and compared the results correlation.Result:118 specimens of invasive ductal carcinoma were seleced, The results tested by IHC were as follows:14 cases(-);20 cases(1+),55 cases(2+),29 cases (3+).The results tested by FISH were as follows: 53 cases >2.2, 64 cases <1.8,1 case was 1.8-2.2.HER-2 positive coincidence rate was 96.6%(28/29) by IHC detection in positive cases by FISH detection,HER-2 negative by FISH were in negative of IHC detection, the coincidence rate was 100%(34/34).25 HER-2 positive cases by FISH detection were among 55 cases of HER-2(2+) by IHC detection, and 30 were the negative.5 cases on chromosome multi-body in 17 were found by FISH detection,its incidence rate was 4.24%.HER-2 expression in 8 cases with of breast cancer exists heterogeneity by IHC detection,and the heterogeneity was also confirmed in FISH detected.Conclusion:HER-2 of breast infiltrating ductal carcinoma by IHC detection was high consistency with FISH detection,HER-2 cases(2+) by immunohistochemical need to be detected by FISH.
【Key words】 Infiltrating ductal carcinoma; HER-2; Immunohistochemistry; Fluorescence in situ hybridization
正确检测和评定乳腺癌的HER-2蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要,HER-2检测结果不仅涉及患者的预后评估,而且是筛选是否适合针对HER2的靶向治疗的先决条件,并且可以对内分泌治疗、化疗方案的选择起到指导作用[1]。近年,乳腺癌组织中HER-2状态检测的应用技术越来越多。大致分为:(1)基于HER-2蛋白水平的检测,如免疫组织化学(IHC)。(2)基于HER-2基因DNA水平的检测,如荧光原位杂交(FISH)。本文收集本科行IHC检测及FISH的乳腺浸润性导管癌病例118例,比较IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2的一致性,现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2013年11月-2014年10月本科行IHC检测及FISH的乳腺浸润性导管癌病例,共118例。均为女性,其中穿刺标本12例,切除标本106例。
1.2 方法 HER-2基因扩增检测试剂盒购于广州安必平公司。免疫组化HER-2/neu多克隆抗体购自福州迈新。
1.3 检测结果判定标准 参照《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》[2]对检测结果进行判定,并由本院2名经专业培训的病理医师进行判读。
1.3.1 IHC检测HER-2的判定方法 对乳腺浸润性癌的癌细胞膜进行定位后染色。(1)阴性:存在≤10%的不完整细胞膜染色,或者无浸润性癌细胞的染色,则记为(-);(2)弱阳性:>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色,记为(1+);(3)可疑阳性:有两种情况,第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和/或弱至中等强度的细胞膜染色,第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色,记为(2+);(4)强阳性:>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色,记为(3+)[3]。 1.3.2 FISH检测HER-2的判定方法 首先对HE染色切片中的癌细胞区域进行确定,并选择出满意的杂交信号区域,采用100倍油镜经特意性单通道滤光片对癌细胞核中FISH结果进行观察,并进行cutoff值和信号计数的计算。按照试剂说明书的要求,记录60 个相连续的癌细胞核中的双色信号:(1)如红色、绿色两种信号的比值大于2.2,或者众多信号间连接成团时,则不用计数,可归入基因扩增;(2)如两信号的比值处于1.8-2.2之间,则重新再计数60个相连续的癌细胞。若结果同前,则在FISH的检测报告中注释;(3)如红色、绿色两信号间比值小于1.8,不存在HER-2基因的扩增;如不同癌细胞中的HER-2基因扩增现象具有异质性,则需要另选癌区及计数,并注明在检测报告中[4]。
1.4 统计学处理 本研究中数据的收集与处理均由本院数据处理中心专门人员进行,以保证数据真实性与科学性。初步数据录入EXCEL(2003版)进行逻辑校对与分析;并应用SPSS 22.0对资料进行一般描述,计数资料用(%)表示,采用 字2检验;并进行IHC及FISH一致性检验,计算kappa值和P值,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IHC及FISH检测结果 IHC检测结果为:(-)病例比例为11.86%;(1+)病例占16.95%,(2+)病例占46.61%,(3+)病例占24.58%。FISH检测结果为:53例为比值>2.2,64例比值<1.8,1例比值为1.8-2.2。见表1。
2.2 本组118例病例中HER-2在伴或不伴17号染色体患者中的基因分状态分布状况分析 IHC检测到8例乳腺癌HER-2表达存在异质性,其发生率为6.78%,异质性在FISH中亦得到证实。FISH检测共发现5例17号染色体多体,其发生率为4.24%,均为IHC(3+)病例。见表2。
2.3 IHC及FISH检测一致性分析 IHC阳性病例29例,FISH检测比值>2.2有28例,1例为1.8-2.2;IHC阴性病例34例,FISH检测比值均为<1.8。免疫组化阳性病例及阴性病例与FISH符合率为98.41%(62/63),kappa值为0.968,P=0.000,具有高度一致性。
3 讨论
HER-2是人类17q21染色体上的基因。该基因的表达不仅和肿瘤的发生、发展相关,更是临床预后评估的重要指标[5]。乳腺癌组织中HER-2状态检测的应用技术越来越多,关于基于HER-2蛋白水平的检测,与基因HERR-2的DNA水平的检测相比,哪种方法更为准确可靠,大多数学者的争论甚多,而争论的焦点在于对17号染色体的多体性的认识[6]。目前研究显示整条17号染色体的多体罕见,CEPl7的多体并不能代表整条第17号染色体多体,部分乳腺癌中17号染色体存在HER-2基因和着丝粒的共同扩增[7]。越来越多的学者认为,HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要[8]。因此,美国ASCO/CAP 2013版HER-2检测指南及我国《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》[2]均强调质量控制,同时推荐了IHC及ISH(in situ hybridization,原位杂交)两种方法。
研究资料显示,IHC检测为-、1+、2+、3+中FISH的符合率分别分:100%、100%、45.45%、96.55%;同时在本研究的118例病例中,IHC与FISH检测乳腺浸润性导管癌HER-2的结果具有高度一致性。与Viale等学者的研究结果相似[9]。IHC是一项广泛而实用的技术,具有检测成本低、操作简单、耗时短、可实现自动化检测和染色后切片便于存档等优点,阅片时可同时进行组织形态学评价,因此,成为乳腺癌患者检测HER-2扩增最常使用的方法[10]。但IHC是一种半定量的方法,结果判定的标准为描述性语言,判读的主观影响较大,未经严格培训的医师判定一致性偏低,较多的病例归入不确定病例[11-12]。尽管ISH成本较贵,但具有高度的稳定性及重复性,尤其是双探针FISH加入了17号染色体着丝粒探针作为内对照。乳腺癌中常见17号染色体的多体现象,在CEP17中平均每个细胞中都至少3个。相关研究显示,17号染色体的多体会增加浸润导管癌中HER-2基因的拷贝数,从而导致了HER-2基因蛋白的过表达,最终造成了IHC检测假阳性结果[13]。FISH的结果判定更为客观,主观影响很小,经培训的医师间判定的一致性极高,已成为HER-2检测的“金标准”[14],可作为IHC的有益的补充。经阅读相关文献并结合本研究实践后,我们认为免疫组化法检测为(3+)的病例中,IHC和FISH具有较高一致性,可作为诊断的直接依据;而对于诊断为(-)和(1+)的病例而言,IHC结果为阴性者,可选择性予以FISH检测;但检测结果为(2+)的患者,由于两种检测方法的一致性较一般,因此需重点对患者予以FISH检测[15-16]。
综上所述,对于IHC 2+的病例,建议行FISH检测。对于大多数IHC 2+的病例,FISH均能明确HER-2状态,当然,对于FISH无法确定HER-2状态的标本,应积极选择其他方法(如PCR、RNA-ISH等)进行检测。
参考文献
[1]赵伟志,叶晓霞.乳腺浸润性微乳头状癌临床病理学观察及免疫组化分析[J].中国医学创新,2014,3(19):40-43.
[2]《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》编写组.乳腺癌HER2检测指南(2014版)[J]. 中华病理学杂志,2014,43(4):262-267.
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[8]张江宇,王颀,郜红艺,等.IHC和FISH检测乳腺癌HER-2表达的对比研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(6):436-439.
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[10]舒文环,仲伟霞.乳腺癌原发灶与转移灶HR和HER-2一致性的研究现状[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(9):734-736.
[11]刘琪,左文述,王新昭,等.乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶激素受体及HER-2与Ki-67表达相关性分析[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(15):1153-1157.
[12]曹丹霞,何建蓉,沈坤炜,等.激素受体和HER-2及Ki-67预测乳腺癌新辅助化疗疗效价值的分析[J].中华肿瘤防治杂志,2012,19(13):1000-1003.
[13] Han Zhang,Guoping Ren,Xiaoling Wang,et al.HER-2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization(FISH) compared with immunohistochemistry (IHC) in breast cancer:a study of 528 equivocal cases.[J].Breast Cancer Research and Treatment,2012,134(2):743-749.
[14]吕海军,李峰,吴明霞,等.PCR分析FISH与IHC检测人乳腺癌组织中HER-2表达的差异性[J].中国保健营养(中旬刊),2013,15(5):51-52.
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[16] Al Khattabi H,Kelany A,Buhmeida A,et al.Evaluation of HER-2/neu gene amplification by fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry in saudi female breast cancer[J].Anticancer Research,2010,30(10):4081-4088.
(收稿日期:2014-11-07) (本文编辑:陈丹云)