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摘要：采用缓慢生长保存法对花叶金线莲进行离体保存试验。结果表明：在培养温度（24±3）℃，光照强度前3个月1500～2000 lx、3个月后500～1000 lx，光照时间10 h·d-1的培养条件下，花叶金线莲单芽在改良MS+蔗糖20 g·L-1+甘露醇20 g·L-1培养基中保存12个月，存活率达85.0%，保存后能恢复正常生长;缓慢生长保存法可为金线莲种质保存提供新的方法与思路。
关键词：花叶金线莲;缓慢生长;离体保存
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.06.006
Abstract： The method of slow growth conservation was used to conduct the experiment of in vitro conservation of mosaic anoectochilus formosanus. The results showed that： In the culture conditions of the temperature being 24±3℃， the illumination intensity being 1500-2000 lx for the first 3 months and 500-1000 lx after 3 months， and the illumination time being 10 h·d-1， the survival rate of the single bud of mosaic anoectochilus formosanus reached 85.0% after 12 months conservation in the modified MS+sucrose 20 g·L-1+ mannitol 20 g·L-1 medium. And it could restore normal growth after the conservation， which provided a new method and idea for the germplasm conservation of anoectochilus formosanus.
Key words： Mosaic anoectochilus formosanus;Slow growth;In vitro conservation
金線莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵药材，也是十分珍贵的室内小型观叶植物[1-4]。花叶金线莲系金线莲突变自育新品种，因其叶色墨绿色与金黄色相嵌，形成鲜明的色彩对比，色泽亮丽，极具观赏价值，其既可作为药用兼观赏的新品种开发，又可作为试管花卉的工艺品开发应用。作为一种新型草本兰科植物，同其他兰花资源一样，主要是采用田间种植保存和组织培养保存，但金线莲种植保存过程中易受气候条件限制，尤其高温高湿环境条件下，茎腐病等病害为害严重，使活体保存工作难于开展，而组织培养保存需对种质材料进行频繁继代，工作量大、成本高，且可能会发生变异等问题。因此，研究探索一套符合金线莲特点的种质资源保存方法十分必要。
缓慢生长离体保存是近年来新发展且较为有效的种质保存方法，是以组织培养技术为基础，通过改变培养条件，如在培养基中加入化学物质或采用一些物理方法，限制或延缓培养物的生长，使组织或细胞生长降至最小限度，但不死亡或者少量死亡，从而达到延长继代培养的保存方法。其最大优点是可以使保存材料维持不断生长。影响缓慢生长离体保存效果的因素很多，但主要因素是培养基组分和培养条件。通过在保存培养基中添加不同浓度蔗糖、甘露醇、脱落酸、多效唑等对种质离体保存影响的研究，近年来，本课题组在文心兰、蝴蝶兰等兰科植物离体种质保存中有较多的实践[5-7]。目前未见花叶金线莲种质资源离体保存技术的相关报道。本研究利用课题组已建立的花叶金线莲的离体培养再生体系[8]，研究了改良MS基本培养基中添加不同浓度蔗糖及甘露醇对花叶金线莲单芽离体保存的影响，以期为金线莲种质资源保存提供理论和技术参考。
1材料与方法
1.1试验材料
以花叶金线莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.‘Huaye’单芽为离体保存试验材料。试验在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉组培实验室进行。
1.2离体保存方法
陈艺荃等：花叶金线莲离体保存技术研究2019年第6期2019年第6期陈艺荃等：花叶金线莲离体保存技术研究在改良MS基本培养基中添加不同浓度（10、20、30、40、50、60、70 g·L-1）蔗糖，以及添加不同浓度（10、20、30、50 g·L-1）甘露醇。其中改良MS基本培养基组分详见表1，甘露醇处理中均附加蔗糖20 g·L-1。以上每个处理接种5瓶，每瓶接种4株单芽，瓶口用保鲜膜封口。每2个月调查1次存活率（存活率为存活株数与接种株数的比值×100%），不更换培养基连续保存12个月。每个月观察其生长情况和存活率。以上试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。
1.3保存材料的恢复生长
试管苗保存12个月，与60 d继代1次正常培养的对照试管苗各自转接到恢复生长培养基（表2）中进行恢复培养。培养温度为（24±3）℃，光强为1500～2000 lx，光照时间为10 h·d-1。
2结果与分析
2.1蔗糖对花叶金线莲单芽保存的影响
将花叶金线莲单芽接种在添加不同浓度蔗糖的改良MS培养基上保存，保存结果见表3。
表3结果表明，随着保存时间的延长，花叶金线莲单芽存活率随蔗糖浓度的增加而降低;培养基中添加低浓度蔗糖20 g·L-1，在缓慢生长保存12个月后仍保持较高的存活率，达80.0%。说明降低培养基中的蔗糖浓度具有减缓生长，延长保存时间的作用，而高浓度蔗糖可能增加了培养基的渗透压，使植株吸收水分和养分严重受阻，导致生长不良死亡。 2.2甘露醇对花叶金线莲单芽保存的影响
将花叶金线莲单芽接种在添加不同浓度甘露醇的改良MS附加蔗糖20 g·L-1培养基上保存，保存结果见表4。
表4结果表明，在添加不同浓度甘露醇的培养基上，随着保存时间的延长，添加一定浓度的甘露醇对花叶金线莲单芽保存有利，能有效提高其存活率。筛选出适宜花叶金线莲保存的甘露醇浓度为20 g·L-1，保存12个月存活率达85.0%。
综上，适宜花叶金线莲单芽保存的培养基为改良MS+蔗糖20 g·L-1+甘露醇20 g·L-1。
2.3保存材料的恢复生长
经保存的材料，切去根系，将茎段转接到花叶金线莲专用恢复生长培养基中继续培养，生长情况与正常继代苗无明显差异，保存苗均能生根成完整植株。可见，在普通组织培养条件下，保存花叶金线莲试管苗，材料受损伤程度较小，不需长时间恢复。
3结论与讨论
缓慢生长离体保存最大优点是使保存材料维持不断生长。影响其保存效果的因素很多，但主要是培养基组分和培养条件。蔗糖具有双重作用，不仅为试管苗的生长发育提供主要碳源，而且作为一种高渗化合物，起到调节培养基渗透势的作用。本试验结果表明，在培养基中添加20 g·L-1蔗糖对花叶金线莲单芽保存效果最好，能够有效延长继代间隔时间，保存12个月的存活率达80.0%。
在离体种质保存中，培养基中加入一定浓度的甘露醇可减缓植株生长，延长保存时间。甘露醇作用机理是降低了细胞膨压，提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，使水分和养分吸收受阻，减少营养消耗;同时细胞壁酶活性受到抑制，减弱新陈代谢活动，延缓细胞生长。本试验结果表明，在培养基中添加甘露醇20 g·L-1，对花叶金线莲单芽保存效果最好，能够有效延长继代间隔时间，保存12个月的存活率达85.0%，且恢复生长与正常继代苗表现无明显差异。
花葉金线莲通过限制生长法保存，保存12个月期间不需要转接继代，与常规的组织培养保存（2个月继代1次）相比，不仅延长了保存材料的继代间隔期，避免频繁继代，节约培养成本，而且材料一直处于生长状态，可以保持种质优良特性，随时用于扩繁。
参考文献：
[1]罗晓青，吴明开，查兰松.珍稀药用植物金线莲研究现状与发展趋势[J].贵州农业科学，2011，39（3）：71-74.
[2]赵云青，黄颖桢，陈菁瑛，等.金线莲白绢病病原菌分离及分子鉴定[J].福建农业学报，2013，28（4）：357-360.
[3]施满容，龚林光，陆志平，等.闽东野生金线莲有效成分含量的比较[J].福建农业学报，2016，31（9）：950-956.
[4]魏翠华，谢宇，秦建彬，等.不同肥料处理对金线莲产量和品质的影响[J].福建农业学报，2015，30（8）：793-796.
[5]叶秀仙，黄敏玲，吴建设，等.甘露醇和生长抑制剂对文心兰离体保存的影响[J].福建农业学报，2011，26（1）：140-145.
[6]叶秀仙，黄敏玲，钟淮钦， 等.文心兰离体再生体系建立及试管苗种质保存研究[C]//中国观赏园艺研究进展.北京：中国林业出版社，2009，93-197.
[7]叶秀仙，黄敏玲，樊荣辉， 等. 蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究[J].福建农业学报，2014，29（10）：976-981.
[8]叶秀仙，陈艺荃，钟淮钦，等.花叶金线莲茎段诱导植株再生培养技术研究[J].福建农业学报，2018，33（3）：258-262.
（责任编辑：柯文辉）
关键词：花叶金线莲;缓慢生长;离体保存
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.06.006
Abstract： The method of slow growth conservation was used to conduct the experiment of in vitro conservation of mosaic anoectochilus formosanus. The results showed that： In the culture conditions of the temperature being 24±3℃， the illumination intensity being 1500-2000 lx for the first 3 months and 500-1000 lx after 3 months， and the illumination time being 10 h·d-1， the survival rate of the single bud of mosaic anoectochilus formosanus reached 85.0% after 12 months conservation in the modified MS+sucrose 20 g·L-1+ mannitol 20 g·L-1 medium. And it could restore normal growth after the conservation， which provided a new method and idea for the germplasm conservation of anoectochilus formosanus.
Key words： Mosaic anoectochilus formosanus;Slow growth;In vitro conservation
金線莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵药材，也是十分珍贵的室内小型观叶植物[1-4]。花叶金线莲系金线莲突变自育新品种，因其叶色墨绿色与金黄色相嵌，形成鲜明的色彩对比，色泽亮丽，极具观赏价值，其既可作为药用兼观赏的新品种开发，又可作为试管花卉的工艺品开发应用。作为一种新型草本兰科植物，同其他兰花资源一样，主要是采用田间种植保存和组织培养保存，但金线莲种植保存过程中易受气候条件限制，尤其高温高湿环境条件下，茎腐病等病害为害严重，使活体保存工作难于开展，而组织培养保存需对种质材料进行频繁继代，工作量大、成本高，且可能会发生变异等问题。因此，研究探索一套符合金线莲特点的种质资源保存方法十分必要。
缓慢生长离体保存是近年来新发展且较为有效的种质保存方法，是以组织培养技术为基础，通过改变培养条件，如在培养基中加入化学物质或采用一些物理方法，限制或延缓培养物的生长，使组织或细胞生长降至最小限度，但不死亡或者少量死亡，从而达到延长继代培养的保存方法。其最大优点是可以使保存材料维持不断生长。影响缓慢生长离体保存效果的因素很多，但主要因素是培养基组分和培养条件。通过在保存培养基中添加不同浓度蔗糖、甘露醇、脱落酸、多效唑等对种质离体保存影响的研究，近年来，本课题组在文心兰、蝴蝶兰等兰科植物离体种质保存中有较多的实践[5-7]。目前未见花叶金线莲种质资源离体保存技术的相关报道。本研究利用课题组已建立的花叶金线莲的离体培养再生体系[8]，研究了改良MS基本培养基中添加不同浓度蔗糖及甘露醇对花叶金线莲单芽离体保存的影响，以期为金线莲种质资源保存提供理论和技术参考。
1材料与方法
1.1试验材料
以花叶金线莲Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl.‘Huaye’单芽为离体保存试验材料。试验在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉组培实验室进行。
1.2离体保存方法
陈艺荃等：花叶金线莲离体保存技术研究2019年第6期2019年第6期陈艺荃等：花叶金线莲离体保存技术研究在改良MS基本培养基中添加不同浓度（10、20、30、40、50、60、70 g·L-1）蔗糖，以及添加不同浓度（10、20、30、50 g·L-1）甘露醇。其中改良MS基本培养基组分详见表1，甘露醇处理中均附加蔗糖20 g·L-1。以上每个处理接种5瓶，每瓶接种4株单芽，瓶口用保鲜膜封口。每2个月调查1次存活率（存活率为存活株数与接种株数的比值×100%），不更换培养基连续保存12个月。每个月观察其生长情况和存活率。以上试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。
1.3保存材料的恢复生长
试管苗保存12个月，与60 d继代1次正常培养的对照试管苗各自转接到恢复生长培养基（表2）中进行恢复培养。培养温度为（24±3）℃，光强为1500～2000 lx，光照时间为10 h·d-1。
2结果与分析
2.1蔗糖对花叶金线莲单芽保存的影响
将花叶金线莲单芽接种在添加不同浓度蔗糖的改良MS培养基上保存，保存结果见表3。
表3结果表明，随着保存时间的延长，花叶金线莲单芽存活率随蔗糖浓度的增加而降低;培养基中添加低浓度蔗糖20 g·L-1，在缓慢生长保存12个月后仍保持较高的存活率，达80.0%。说明降低培养基中的蔗糖浓度具有减缓生长，延长保存时间的作用，而高浓度蔗糖可能增加了培养基的渗透压，使植株吸收水分和养分严重受阻，导致生长不良死亡。 2.2甘露醇对花叶金线莲单芽保存的影响
将花叶金线莲单芽接种在添加不同浓度甘露醇的改良MS附加蔗糖20 g·L-1培养基上保存，保存结果见表4。
表4结果表明，在添加不同浓度甘露醇的培养基上，随着保存时间的延长，添加一定浓度的甘露醇对花叶金线莲单芽保存有利，能有效提高其存活率。筛选出适宜花叶金线莲保存的甘露醇浓度为20 g·L-1，保存12个月存活率达85.0%。
综上，适宜花叶金线莲单芽保存的培养基为改良MS+蔗糖20 g·L-1+甘露醇20 g·L-1。
2.3保存材料的恢复生长
经保存的材料，切去根系，将茎段转接到花叶金线莲专用恢复生长培养基中继续培养，生长情况与正常继代苗无明显差异，保存苗均能生根成完整植株。可见，在普通组织培养条件下，保存花叶金线莲试管苗，材料受损伤程度较小，不需长时间恢复。
3结论与讨论
缓慢生长离体保存最大优点是使保存材料维持不断生长。影响其保存效果的因素很多，但主要是培养基组分和培养条件。蔗糖具有双重作用，不仅为试管苗的生长发育提供主要碳源，而且作为一种高渗化合物，起到调节培养基渗透势的作用。本试验结果表明，在培养基中添加20 g·L-1蔗糖对花叶金线莲单芽保存效果最好，能够有效延长继代间隔时间，保存12个月的存活率达80.0%。
在离体种质保存中，培养基中加入一定浓度的甘露醇可减缓植株生长，延长保存时间。甘露醇作用机理是降低了细胞膨压，提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，使水分和养分吸收受阻，减少营养消耗;同时细胞壁酶活性受到抑制，减弱新陈代谢活动，延缓细胞生长。本试验结果表明，在培养基中添加甘露醇20 g·L-1，对花叶金线莲单芽保存效果最好，能够有效延长继代间隔时间，保存12个月的存活率达85.0%，且恢复生长与正常继代苗表现无明显差异。
花葉金线莲通过限制生长法保存，保存12个月期间不需要转接继代，与常规的组织培养保存（2个月继代1次）相比，不仅延长了保存材料的继代间隔期，避免频繁继代，节约培养成本，而且材料一直处于生长状态，可以保持种质优良特性，随时用于扩繁。
参考文献：
[1]罗晓青，吴明开，查兰松.珍稀药用植物金线莲研究现状与发展趋势[J].贵州农业科学，2011，39（3）：71-74.
[2]赵云青，黄颖桢，陈菁瑛，等.金线莲白绢病病原菌分离及分子鉴定[J].福建农业学报，2013，28（4）：357-360.
[3]施满容，龚林光，陆志平，等.闽东野生金线莲有效成分含量的比较[J].福建农业学报，2016，31（9）：950-956.
[4]魏翠华，谢宇，秦建彬，等.不同肥料处理对金线莲产量和品质的影响[J].福建农业学报，2015，30（8）：793-796.
[5]叶秀仙，黄敏玲，吴建设，等.甘露醇和生长抑制剂对文心兰离体保存的影响[J].福建农业学报，2011，26（1）：140-145.
[6]叶秀仙，黄敏玲，钟淮钦， 等.文心兰离体再生体系建立及试管苗种质保存研究[C]//中国观赏园艺研究进展.北京：中国林业出版社，2009，93-197.
[7]叶秀仙，黄敏玲，樊荣辉， 等. 蝴蝶兰离体保存及其遗传稳定性研究[J].福建农业学报，2014，29（10）：976-981.
[8]叶秀仙，陈艺荃，钟淮钦，等.花叶金线莲茎段诱导植株再生培养技术研究[J].福建农业学报，2018，33（3）：258-262.
（责任编辑：柯文辉）