【摘 要】
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目的 本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR Green Ⅰ,通过茎-环法设计原理,建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法.方法 利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列,分
【机 构】
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遵义医学院免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地,贵州遵义563099贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室,贵州遵义563099;遵义医学院医学物理学教研室,贵州遵义,563099;
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目的 本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR Green Ⅰ,通过茎-环法设计原理,建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法.方法 利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列,分别设计1条miR-7特异性反转录引物,以及Real-time PCR上游和下游引物;观察不同退火温度和不同引物浓度对扩增miR-7的Ct值影响,选择最优的退火温度和引物浓度;测定不同稀释度RNA下Real-time PCR扩增miR-7的效果;并利用该方法检测小鼠4个器官中miR-7的灵敏性和特异性.结果 在基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR检测法中,miR-7扩增的最优退火温度为60℃,最优引物浓度为10 μmol/L;在不同稀释度RNA下miR-7的Ct值线性关系较好,且在模板RNA低于100 pg的条件下,该方法仍可有效检测miR-7分子;最后有效检测出小鼠4个不同器官中miR-7的差异性表达.结论 成功建立基于SYBR Green Ⅰ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7的方法,可为后续研究miR-7的生物学功能提供了重要工作基础.
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