目的　观察设计的三步酶消化法分离原代关节软骨细胞的效果,并对体外培养不同代次细胞的生物学活性进行评价。方法　三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶及1g/LEDTA混合液、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化。结果　(1)关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为50 3×106 个细胞,细胞存活率平均为98. 8%。(2)原代和第一代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(92±10)μg/cm2;第三代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应明显减弱,第四代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(48±12)μg/cm2。结论　(1)三步酶消化法可使关节软骨基质完全消化降解,具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作简便等特点。(2)原代和第一代软骨细胞具有良好的生物学活性,而第三代以后的细胞生物学活性低下。