【摘 要】
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目的 优化原生质体介导的马尔尼菲青霉转化体系,为其基因功能研究提供良好的平台.方法 通过原生质体介导将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺
【机 构】
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中山大学孙逸仙纪念医院,广州,510120
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目的 优化原生质体介导的马尔尼菲青霉转化体系,为其基因功能研究提供良好的平台.方法 通过原生质体介导将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株ligD(pyrG-,ligD-)中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子,运用PCR验证重组子,通过改变影响转化效率的酶解时间、培养基浓度、质粒浓度、不同配方的原生质体洗涤液STC和不同配方的原生质体助融剂PTC 5个条件对体系进行优化.结果 PCR验证A.nidulans pyrG基因成功的插人ligD中,转化子可稳定传代.最适合ligD原生质体转化效率的条件为:酶解时间6h,PTC (60％ PEG-4000,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2),每100 tL原生质体(106～107/mL)加入2.5 μg质粒,0.6 mol/L蔗糖SD/SDU筛选/再生培养基,每1μg质粒转化子可达68个左右.结论 成功优化了原生质体介导马尔尼菲青霉转化体系的条件,优化后该方法转化效率高,为基因功能研究提供良好平台.
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