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摘 要 在运用显微镜计数法进行白细胞计数的实验教学中，容易出现一些问题，如技术误差、固有误差、仪器误差等。经过多年的教学总结和仔细分析，得出一些相应的解决方法，以期共同探讨。
关键词 中职检验专业；白细胞计数实验；误差
中图分类号：G712 文献标识码：B
文章编号：1671-489X（2017）03-0142-03
1 引言
中职学校检验专业学生在进行白细胞计数实验中，容易出现实验器材使用不当、实验操作不规范或对实验理论知识不理解而导致实验结果偏差甚至实验过程受阻等；另外，即使一位技术熟练者，使用同一仪器在对同一标本进行连续多次操作，检测结果也常有一定差异。本文提出白细胞计数实验中容易出现的一些问题即技术误差、固有误差以及仪器误差等进行分析探讨且给出相应的解决方法，以尽力避免学生在实验过程中出现的错误操作或无效操作，提高学生操作效率及能力，达到更好的教学效果。
2 技术误差
由于操作不正确或仪器不精确造成的误差为技术误差。这类误差通过主观努力可以避免或降到最低程度[1]。
采血部位不同结果产生偏差 世界卫生组织（WHO）推荐采血部位以左手无名指或中指指尖的内侧为宜。在我国有些地方仍采用耳垂取血，耳垂部位痛感较轻且不易感染，但其血循环较差，受温度变化影响较大，所以一般情况下采用手指部位取血。在学生实验操作时，笔者将30名学生同时采指血和耳垂血，分别进行采血取样进行对照。计数结果是耳垂血白细胞数高于手指血白细胞数的为28例，约占93.3%，平均数值增高1.9×109/L。白细胞数目的多少可能与所在采血部位的血管深浅、粗细、血流速度、血液粘滞度等多种因素有关。耳垂白细胞计数偏高的主要原因可能是耳垂体积小散热快，所处环境温度低，血流慢，血液粘滞度大，白细胞易于沉积。手指则不然，手指活动量大、体积大，温度相对高，血流快，血液粘滞度小，白细胞不易沉积，所以这些可能是手指血白细胞计数偏低的主要原因[2]。
计数板不清洁干燥
1）计数板的清洁方法。血细胞计数板使用后，取下盖玻片，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗后自行晾干或用吹风机吹干，也可用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
另外，计数板冲洗后，还要通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止，干燥后方可放入盒内保存或使用。
2）计数板上残存水滴，会使充液不均，还会造成混合液浓度降低[3]。解决方法：将计数板置于清洁环境，自然干燥或在空气中快速挥动，如急用也可轻轻甩掉计数板上水滴后再用滤纸片将残存水分吸干。
3）计数板上残留纤维等杂质影响镜下观察清晰度。解决方法：用流动的清水洗净计数板后再进行上述具体操作。
微量吸管使用不当 本实验采用一种改进的微量吸管，属于医疗器械技术领域。它由气囊和与之管通的吸管一体构成，气囊与吸管管通一端的底部具有孔，吸管上标有刻度，故可在采取样液时利用指压启闭其孔实现准确性，该吸管具有造价低、精确度高、操作简便灵活的特点，又具有可作为一次性产品使用，能够避免交叉感染等的优点。
1）微量吸管折断。解决方法：微量吸管细长易断，在将其插入橡胶头内时，应左手持橡胶头（注意气囊孔的控制），右手必须持住靠近微量吸管上端的部分轻轻操作，才能有效防止其折断。
2）微量吸管取样混有气泡。解决方法：取样时，需将微量吸管末端完全浸入血样末端，轻轻抽吸，才不会混入空气。
3）血样进入橡胶头。解决方法：取样前应先捏紧橡胶头，封闭气孔，取样时将橡胶头慢慢地、一点一点地松开，如果松开速度过快或力度过大，就会发生上述现象[4]。
取樣操作不规范 以用一次性定量（20 μl）微量吸管取末梢血为例，正确操作是：轻轻吸取末梢血到微量吸管第二个刻度线后再多取一点儿，此时右手捏稳橡胶头不动，左手持干棉球置于微量吸管管尖部位，右手轻捏橡胶头挤出管内多余血样至刚好到吸管第二个刻度线为止，此时再用左手的棉球将管尖外多余血液擦掉。上述每一步骤缺一不可。
充液不当
1）充液量过少造成充液缺损，过多则造成盖玻片悬浮，细胞飘忽不定。
2）充液时玻棒位置不正确，造成充液缺损或有气泡。正确操作是：用玻棒蘸取适量混悬液后应轻轻接触盖玻片一角，让液体自动进入计数池并刚好充满后立即移走玻棒。
3）充液时间延迟。混悬液完成后应立即充液观察计数，有实验证明如果混悬液放置超过1.5分钟以上在进行充液计数操作，会使计数结果偏低[5]。白细胞在刚刚混匀的液体中均匀分布，而静置超过1.5分钟后白细胞会逐渐下沉，造成混悬液密度不均，在吸取上层液体充液进行计数时会产生偏差[5]。
低倍镜下看不到计数池
1）了解计数板的构造。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4个槽构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两个计数区，每个计数区上面各刻有一方格网，每个方格网共分9个大方格，4个角的大方格作为白细胞计数用，每个大方格被单线划分成16个中方格；最中央大方格被双线划分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，供计数密度较大的红细胞计数时使用。每个计数区由400个小方格组成，计数区边长为1 mm，
则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4000 mm3。
2）计数板放置位置不正确。计数板有上下两个相同的计数池，应将要观察的、充好液的一侧置于视野中央。
3）光线过强。计数板放置好后，调整好焦距，如仍看不到计数池上的画线，可能是光线过强的缘故，调整显微镜光圈或遮光镜至视野较暗，再调整细准焦螺旋至视野清晰即可看到计数池上的画线[6]。 辨別不出计数池4个角大方格的位置，解决方法如下。
1）先找到计数池内最中央的大方格，特点是横线与竖线均为双线划分的含有25个中方格的大方格，也是线条最密集的大方格就是计数池内最中央的大方格。
2）以最中央大方格为标的，分别沿上、下、左、右方向移动计数板，找到外侧两边为单线、内侧两边为双线的含16个中方格的大方格即分别为四个角上的大方格。
显微镜下将杂质误认为白细胞
1）粉尘颗粒。粉尘颗粒不具备细胞的基本形态，低倍镜下白细胞呈圆形，细胞内有深色的核，上下微调细准焦螺旋白细胞具有折光性。
2）气泡。气泡亦不具备细胞的基本形态，微调细准焦螺旋时镜下显现为无细胞结构的空圈。
漏数或重复计数
1）每一个角上的大方格都被划分为16个中方格，计数时应以中方格为依据，按一定方向和顺序计数，如从上到下、从左到右的顺序。
2）对压线的白细胞应采取数上不数下、数左不数右的原则。
3 固有误差
由于因每次白细胞分布不可能完全相同而造成的偏差叫固有误差[1]。
计数池内细胞分布不均 白细胞总数在正常参考范围内时，若每个大方格的白细胞数值相差8个以上视为细胞分布严重不均，可能是混合液密度不均或充液不当，需轻轻摇匀混合液重新充液计数。
根据统计学研究白细胞在技术池内的分布符合Poison分布。其变异系数CV=1/m?，m代表计数池重复计数的白细胞均数。
通过上式可以得出m越大，CV越小，所以计数范围越大，计数细胞越多，计数域误差越小。
常规考核标准 学生计数完毕后，通常要用常规计算标准公式来评判实验结果是否达标，否则要重新采血充液计数。即：
RCS=（4个大方格所数白细胞数最大值-最小值）/4个大方格所数白细胞平均数
评价标准：白细胞≤4×109/L时，RCS<0.3
白细胞=（4.1～14.9）×109/L时，RCS<0.2
白细胞≥15×109/L时，RCS<0.15
超过上述标准为不合格。
4 仪器误差
计数板的鉴定 要求计数板的台面光滑、透明，画线清晰，计数池画线面积准确，必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数池的边长与底面积，用微米千分尺测量计数池的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即1±0.01 mm，深度误差应小于2%，即0.1±0.002 mm。若超过上述标准，应弃之不用。
盖玻片的标准 盖玻片应平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002 mm之内，必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数池表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也达标。如果盖玻片不达标势必会影响实验结果的准确性。
5 其他情况
白细胞总数过低 计数完成后，白细胞总数过低者（<3×109/L），可扩大计数区域或重新加倍取血计数。
白细胞总数过高 对于白细胞总数过高者（>15×109/L），
可增加稀释倍数重新计数，如若是外周血中有核红细胞过多，必须再进行白细胞分类计数，然后用校正公式予以校正除去。
校正公式[1]：白细胞总数=校正前白细胞数×[100/
（100 100个白细胞中的有核红细胞数）]
以上所述大致涵盖了学生在白细胞计数实验中容易出现的问题，若能有效克服，必定会大大增强实验结果的可靠性。另外，熟能生巧，该项实验初次完成后，建议再利用一些课时进行白细胞计数实验的技能考试，强化规范操作，为日后进行红细胞计数及血小板计数等实验打下良好基础。
参考文献
[1]安艳，赵平.临床检验[M].2版.北京：人民卫生出版社，2008.
[2]张燕凌.关于“白细胞计数误差大”问题的探讨[J].洛阳理工学院学报：自然科学版，1994（4）：64-66.
[3]王霞.血常规检验的常见误差原因分析[J].健康导报：医学版，2014，1（5）：67.
[4]潘顺华.血常规检验的常见错误原因分析[J].医药前沿，2016，6（24）：374-375.
[5]郭汉英.关于白细胞计数测定时间的探讨[J].河南医药信息，1995（2）：5.
[6]杨必清，番云华，李轶勋.血液细胞分析显微镜复片的必要性探讨[J].中国民康医学，2014（18）：17-18.
作者：王新华，锦州市卫生学校（121000）。
关键词 中职检验专业；白细胞计数实验；误差
中图分类号：G712 文献标识码：B
文章编号：1671-489X（2017）03-0142-03
1 引言
中职学校检验专业学生在进行白细胞计数实验中，容易出现实验器材使用不当、实验操作不规范或对实验理论知识不理解而导致实验结果偏差甚至实验过程受阻等；另外，即使一位技术熟练者，使用同一仪器在对同一标本进行连续多次操作，检测结果也常有一定差异。本文提出白细胞计数实验中容易出现的一些问题即技术误差、固有误差以及仪器误差等进行分析探讨且给出相应的解决方法，以尽力避免学生在实验过程中出现的错误操作或无效操作，提高学生操作效率及能力，达到更好的教学效果。
2 技术误差
由于操作不正确或仪器不精确造成的误差为技术误差。这类误差通过主观努力可以避免或降到最低程度[1]。
采血部位不同结果产生偏差 世界卫生组织（WHO）推荐采血部位以左手无名指或中指指尖的内侧为宜。在我国有些地方仍采用耳垂取血，耳垂部位痛感较轻且不易感染，但其血循环较差，受温度变化影响较大，所以一般情况下采用手指部位取血。在学生实验操作时，笔者将30名学生同时采指血和耳垂血，分别进行采血取样进行对照。计数结果是耳垂血白细胞数高于手指血白细胞数的为28例，约占93.3%，平均数值增高1.9×109/L。白细胞数目的多少可能与所在采血部位的血管深浅、粗细、血流速度、血液粘滞度等多种因素有关。耳垂白细胞计数偏高的主要原因可能是耳垂体积小散热快，所处环境温度低，血流慢，血液粘滞度大，白细胞易于沉积。手指则不然，手指活动量大、体积大，温度相对高，血流快，血液粘滞度小，白细胞不易沉积，所以这些可能是手指血白细胞计数偏低的主要原因[2]。
计数板不清洁干燥
1）计数板的清洁方法。血细胞计数板使用后，取下盖玻片，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗后自行晾干或用吹风机吹干，也可用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。
另外，计数板冲洗后，还要通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止，干燥后方可放入盒内保存或使用。
2）计数板上残存水滴，会使充液不均，还会造成混合液浓度降低[3]。解决方法：将计数板置于清洁环境，自然干燥或在空气中快速挥动，如急用也可轻轻甩掉计数板上水滴后再用滤纸片将残存水分吸干。
3）计数板上残留纤维等杂质影响镜下观察清晰度。解决方法：用流动的清水洗净计数板后再进行上述具体操作。
微量吸管使用不当 本实验采用一种改进的微量吸管，属于医疗器械技术领域。它由气囊和与之管通的吸管一体构成，气囊与吸管管通一端的底部具有孔，吸管上标有刻度，故可在采取样液时利用指压启闭其孔实现准确性，该吸管具有造价低、精确度高、操作简便灵活的特点，又具有可作为一次性产品使用，能够避免交叉感染等的优点。
1）微量吸管折断。解决方法：微量吸管细长易断，在将其插入橡胶头内时，应左手持橡胶头（注意气囊孔的控制），右手必须持住靠近微量吸管上端的部分轻轻操作，才能有效防止其折断。
2）微量吸管取样混有气泡。解决方法：取样时，需将微量吸管末端完全浸入血样末端，轻轻抽吸，才不会混入空气。
3）血样进入橡胶头。解决方法：取样前应先捏紧橡胶头，封闭气孔，取样时将橡胶头慢慢地、一点一点地松开，如果松开速度过快或力度过大，就会发生上述现象[4]。
取樣操作不规范 以用一次性定量（20 μl）微量吸管取末梢血为例，正确操作是：轻轻吸取末梢血到微量吸管第二个刻度线后再多取一点儿，此时右手捏稳橡胶头不动，左手持干棉球置于微量吸管管尖部位，右手轻捏橡胶头挤出管内多余血样至刚好到吸管第二个刻度线为止，此时再用左手的棉球将管尖外多余血液擦掉。上述每一步骤缺一不可。
充液不当
1）充液量过少造成充液缺损，过多则造成盖玻片悬浮，细胞飘忽不定。
2）充液时玻棒位置不正确，造成充液缺损或有气泡。正确操作是：用玻棒蘸取适量混悬液后应轻轻接触盖玻片一角，让液体自动进入计数池并刚好充满后立即移走玻棒。
3）充液时间延迟。混悬液完成后应立即充液观察计数，有实验证明如果混悬液放置超过1.5分钟以上在进行充液计数操作，会使计数结果偏低[5]。白细胞在刚刚混匀的液体中均匀分布，而静置超过1.5分钟后白细胞会逐渐下沉，造成混悬液密度不均，在吸取上层液体充液进行计数时会产生偏差[5]。
低倍镜下看不到计数池
1）了解计数板的构造。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4个槽构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两个计数区，每个计数区上面各刻有一方格网，每个方格网共分9个大方格，4个角的大方格作为白细胞计数用，每个大方格被单线划分成16个中方格；最中央大方格被双线划分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，供计数密度较大的红细胞计数时使用。每个计数区由400个小方格组成，计数区边长为1 mm，
则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1 mm，所以每个计数区的体积为0.1 mm3，每个小方格的体积为1/4000 mm3。
2）计数板放置位置不正确。计数板有上下两个相同的计数池，应将要观察的、充好液的一侧置于视野中央。
3）光线过强。计数板放置好后，调整好焦距，如仍看不到计数池上的画线，可能是光线过强的缘故，调整显微镜光圈或遮光镜至视野较暗，再调整细准焦螺旋至视野清晰即可看到计数池上的画线[6]。 辨別不出计数池4个角大方格的位置，解决方法如下。
1）先找到计数池内最中央的大方格，特点是横线与竖线均为双线划分的含有25个中方格的大方格，也是线条最密集的大方格就是计数池内最中央的大方格。
2）以最中央大方格为标的，分别沿上、下、左、右方向移动计数板，找到外侧两边为单线、内侧两边为双线的含16个中方格的大方格即分别为四个角上的大方格。
显微镜下将杂质误认为白细胞
1）粉尘颗粒。粉尘颗粒不具备细胞的基本形态，低倍镜下白细胞呈圆形，细胞内有深色的核，上下微调细准焦螺旋白细胞具有折光性。
2）气泡。气泡亦不具备细胞的基本形态，微调细准焦螺旋时镜下显现为无细胞结构的空圈。
漏数或重复计数
1）每一个角上的大方格都被划分为16个中方格，计数时应以中方格为依据，按一定方向和顺序计数，如从上到下、从左到右的顺序。
2）对压线的白细胞应采取数上不数下、数左不数右的原则。
3 固有误差
由于因每次白细胞分布不可能完全相同而造成的偏差叫固有误差[1]。
计数池内细胞分布不均 白细胞总数在正常参考范围内时，若每个大方格的白细胞数值相差8个以上视为细胞分布严重不均，可能是混合液密度不均或充液不当，需轻轻摇匀混合液重新充液计数。
根据统计学研究白细胞在技术池内的分布符合Poison分布。其变异系数CV=1/m?，m代表计数池重复计数的白细胞均数。
通过上式可以得出m越大，CV越小，所以计数范围越大，计数细胞越多，计数域误差越小。
常规考核标准 学生计数完毕后，通常要用常规计算标准公式来评判实验结果是否达标，否则要重新采血充液计数。即：
RCS=（4个大方格所数白细胞数最大值-最小值）/4个大方格所数白细胞平均数
评价标准：白细胞≤4×109/L时，RCS<0.3
白细胞=（4.1～14.9）×109/L时，RCS<0.2
白细胞≥15×109/L时，RCS<0.15
超过上述标准为不合格。
4 仪器误差
计数板的鉴定 要求计数板的台面光滑、透明，画线清晰，计数池画线面积准确，必要时采用严格校正的目镜测微计测量计数池的边长与底面积，用微米千分尺测量计数池的深度。美国国家标准局（NBS）规定每个大方格边长的误差应小于1%，即1±0.01 mm，深度误差应小于2%，即0.1±0.002 mm。若超过上述标准，应弃之不用。
盖玻片的标准 盖玻片应平整、光滑、无裂痕，厚薄均匀一致，可使用卡尺多点测量（至少在9个点），不均匀度在0.002 mm之内，必要时采用平面平行仪进行测量与评价，要求呈现密集平行的直线干涉条纹。最简单的评价方法是将洁净的盖片紧贴于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的时间不脱落，落下时呈弧线形旋转，表示盖片平整、厚薄均匀。同时，合格的盖片放置在计数池表面后，与支持柱紧密接触的部位可见到彩虹。精选出的盖片与其他盖片紧密重合后，在掠射光线下观察，如见到完整平行的彩虹条纹表示另一枚盖片质量也达标。如果盖玻片不达标势必会影响实验结果的准确性。
5 其他情况
白细胞总数过低 计数完成后，白细胞总数过低者（<3×109/L），可扩大计数区域或重新加倍取血计数。
白细胞总数过高 对于白细胞总数过高者（>15×109/L），
可增加稀释倍数重新计数，如若是外周血中有核红细胞过多，必须再进行白细胞分类计数，然后用校正公式予以校正除去。
校正公式[1]：白细胞总数=校正前白细胞数×[100/
（100 100个白细胞中的有核红细胞数）]
以上所述大致涵盖了学生在白细胞计数实验中容易出现的问题，若能有效克服，必定会大大增强实验结果的可靠性。另外，熟能生巧，该项实验初次完成后，建议再利用一些课时进行白细胞计数实验的技能考试，强化规范操作，为日后进行红细胞计数及血小板计数等实验打下良好基础。
参考文献
[1]安艳，赵平.临床检验[M].2版.北京：人民卫生出版社，2008.
[2]张燕凌.关于“白细胞计数误差大”问题的探讨[J].洛阳理工学院学报：自然科学版，1994（4）：64-66.
[3]王霞.血常规检验的常见误差原因分析[J].健康导报：医学版，2014，1（5）：67.
[4]潘顺华.血常规检验的常见错误原因分析[J].医药前沿，2016，6（24）：374-375.
[5]郭汉英.关于白细胞计数测定时间的探讨[J].河南医药信息，1995（2）：5.
[6]杨必清，番云华，李轶勋.血液细胞分析显微镜复片的必要性探讨[J].中国民康医学，2014（18）：17-18.
作者：王新华，锦州市卫生学校（121000）。