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[摘要]目的：分析1例经基因分析确诊的枫糖尿症患儿的临床及遗传学特点。方法：回顾性分析1例枫糖尿症患儿的临床经过，采用二代测序及桑格尔测序进行致病基因分析，并进行文献复习。结果：男性患儿，于生后6天出现反应差、呕吐、抽搐及昏迷，经颅脑核磁检查，血液氨基酸、酯酰肉碱谱分析考虑枫糖尿症可能性大。BCKDHB基因分析发现c.767A>C（p.Y256C）及c.1037A>G（p.Q346R）复合杂合突变。结论：患儿存在代谢性脑病、代谢性酸中毒及特殊枫糖样体味时，要考虑枫糖尿症的可能，枫糖尿症相关基因（BCKDHA，BCKDHB，DLD，DBT）分析有助于确诊。
[关键词]枫糖尿症;BCKDHB基因;支链氨基酸;遗传代谢病
[中图分类号]R722.1 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）05-221-02
枫糖尿症（maplC syrup urine disease，MSUD，MIM#248600），是一种罕见的常染色体隐性遗传病，以急性代谢紊乱、酮尿、癫痫、智力运动发育后或及枫糖样体味为主要特征。该病若不经及时治疗，急性代谢紊乱及脑损害可呈急性进展，常导致严重脑损伤，且致死、致残率极高。据国外文献报道，枫糖尿症发病率约为1：18000，我国发病率尚不明确。本文就一例经基因诊断明确的中国枫糖尿症患儿的诊疗经过、基因突变特点进行研究，并结合文献进行分析。
1资料与方法
1.1一般资料患儿，男，为第1胎，于胎龄39周顺产出生，出生体重3500g，Apgar评分1分钟9分，5分钟10分。患儿为母乳喂养，于生后6天出现反应差及呕吐，呕吐物为胃内容物，呕吐约一天3-4次，为非喷射性，和进食无关，于呕吐后肢体抽搐发作并意识丧失。于当地医院查血常规示白细胞计数22x109/L，中性粒细胞比例78%，血红蛋白102g/L;血生化：钾2.3mmol/L，钠119mmol/L，氯91mmol/L，碳酸氢根14.2mmol/L;血气pH 7.12;肝肾功能、血脂、血糖、免疫等化验无异常。采用串联质谱查血亮氨酸屏亮氨酸539.10umol/L（正常50-290umol/L）;缬氨酸294.15umol/L（正常60-290umol/L）;别异亮氨酸91.33umol/L（正常<7.70umol/L）。采用气相色谱质谱联用查尿有机酸分析示多种α-酮酸及α-羟酸水平增高。颅脑核磁（T2WI及DWI）示两双侧基底节区、脑干及小脑呈对称性高信号改变。结合患儿枫糖样体味，当地医院予“枫糖尿症，代谢性酸中毒，电解质紊乱，贫血”诊断，予限制天然蛋白建议、予低支链氨基酸配方奶粉、左卡尼汀、维生素B1、止吐、抗炎、抗感染、止惊治疗两周后癥状好转，但仍存在反应慢。患儿父母健康，无亲缘关系，父母家族中未有类似家族史。为明确疾病遗传学诱因，患儿家长来我院进行遗传分析。签署知情同意书后，采集3名家庭成员外周静脉血2-3mL，乙二胺四乙酸抗凝，置4℃冰箱备用。
1.2方法使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，离心柱型）提取患儿及父母外周血白细胞DNA。对患儿DNA进行全外显子测序检查（安捷伦V6），原始测序数据量为5G，平均测序深度约为100x，Q30均大于95%。比对参考基因组（bg19）后，除去PCR重复，并将部分原始结果重新排列。检出变异并进行过滤后.采用annovar进行变异注释。由于临床已确诊，故先关注枫糖尿症相关基因，并明确BCKDHB基因疑似致病突变位点。
检出疑似致病位点后，由NCBI网站下载BCKDHB基因DNA全序列（NM 000.056）。采用Primer5软件设计聚合酶链反应引物，对患儿家系DNA进行扩增。胶回收以及纯化后，采用双向测序法进行基因序列分析，然后与标准序列进行比对分析。利用NCBI蛋白数据库和Bioedit软件进行人类和不同物种的BCKDHB蛋白同源序列比较，并运用MutalaonTaster软件（http：//www.mutationtaster.org）及Polyphen-2软件（http：//genetms.bwh.harvard.edu/pph2）进行突变的致病性预测。
2结果
患儿存在c.767A>C（p.Y256C）及c.1037A>G（p.Q346R）复合杂合突变，家系分析示突变源于患儿父母，符合枫糖尿症诊断。突变均为已报道突变，在千人基因组计划资料库（www.1000genomes.org）中未检出。上述突变经MutationTaster和Polyphen-2软件致病性预测为“可能致病：经多物种同源性分析示256号及346号氨基酸在多物种间高度保守（图1），结合既往文献，考虑该两个突变致病的可能性大。
3讨论
枫糖尿症是线粒体支链。α-酮酸脱氢酶缺陷引发的遗传代谢病。由于支链氨基酸及支链酮酸在患儿体内积聚，可影响大脑乙酰胆碱酯酶活性、引起大脑氧化损伤、干扰大脑能量代谢、影响髓磷脂合成、另脑细胞内外渗透压改变，进而引发代谢性脑病、脑水肿，及髓鞘形成障碍。同时，患儿体内蓄积的代谢产物表现为枫糖样体味。
根据残存酶活性，将枫糖尿症分为5种亚型，经典型、间歇型、中间型、维生素B1有效型及二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶（E3）缺乏型。其中，经典型最为常见。新生儿起病的患儿常为经典型，大多数于出生时无明显异常，于生后一周内出现喂养困难、反应差、嗜睡等症状，可出现枫糖样体味。若不及时治疗，则病情大都进展迅速，出现进一步神经系统损伤，可表现为痉挛性瘫痪、癫痫、昏迷等症状，病情严重时颅脑核磁可有脑白质海绵状变性该病，急性期可出现脑水肿，致死率及致残率极高。本文患儿临床经过典型，于生后6天以反应差、呕吐及抽搐起病，后昏迷，疾病进展迅速，考虑为经典型枫糖尿症。 枫糖尿症可经典型临床症状、生化及影像学异常、遗传学缺陷进行诊断，特异性的生化异常为枫糖尿症的快速诊断提供可能。生化异常包括血液氨基酸、酰基肉碱谱的支链氨基酸水平增高，以及尿液α-酮酸、α一羟酸的蓄积改变。血液串联质谱检查是新生儿筛查的方法之一，在多个发达国家，及我国部分地区已得以开展，并检出多种遗传代谢病患儿，包括枫糖尿症。和大多数遗传代谢病相似，枫糖尿症的病因在于毒性物质在体内的蓄积，故早筛查，早阻断毒性物质沉积，与疾病的转归和预后极为相关。枫糖尿症可通过限制毒性产物上游物质摄入及补充相应辅酶进行治疗，部分症状可治愈或缓解，颅脑损伤在一定情况下也可逆，但预后差异较大。除饮食及药物治疗外.因支链α-酮酸脱氢酶缺陷在肝脏中表达，故近年来肝移植在枫糖尿症的治疗中取得了一定疗效，血支链氨基酸水平可下降至正常。虽本文患儿未经血串联质谱进行新生儿筛查，但确诊及时，并在新生儿期及时限制天然蛋白摄入并补充祛支链氨基酸配方奶粉，给予左卡尼汀及维生素B1治疗，并行纠正电解质紊乱、止惊、止吐、纠酸、补液等对症治疗后，呕吐、抽搐及电解质紊乱得以纠正，但仍存在反应差的现象，且未复查颅脑核磁明确脑损伤变化，需长时间随访以明确其预后。
因枫糖尿症与支链α-酮酸脱氢酶相关，而支链α-酮酸脱氢酶由4个亚单位，E1α，E1β，E2及E3組成，每个亚单位异常都会引发枫糖尿症发生。故该病可由4种基因异常引发，分别是BCKDHA，BCKDHB，DLD及DBT，其中，BCKDHA基因缺陷最为常见。虽然4种基因缺陷均可引发枫糖尿症发生，但目前研究考虑BCKDHA及BCKDHB基因缺陷与经典型枫糖尿症更为相关，而DBT基因缺陷患者症状常较BCKDHA及BCKDHB基因缺陷患者轻，多与维生素B1有效型相关。本研究检出编码支链α-酮酸脱氢酶E1βB亚单位的BCKDHB基因复合杂合突变。该基因编码位于6号染色体上，编码的E1β亚单位由392个氨基酸组成。迄今已发现115个致病突变（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac）。在美国部分枫糖尿症患者中BCKDHA基因c.1312T>A为热点突变，BCKDHB基因尚未有相关热点突变的报道。本文研究的突变均为已知突变，且仅在中国患者申报道过，不排除上述突变在中国人群特异突变的可能。两个突变在物种间保守，并经预测软件预测致病可能性大，结合临床表现可予患者遗传学确诊。
本研究报道一例枫糖尿症患儿，以呕吐、枫糖样体味及抽搐为主要表现，并明确了遗传学诱因。建议对不明原因的代谢性酸中毒、代谢性脑病及特殊体味的患儿，尤其颅脑核磁有枫糖尿症特异性改变的患儿，应结合.临床特征、血液生化等鉴别诊断，争取基因分析协助确诊，并及时通过限制相关饮食、补充特殊奶粉及相应辅酶进行治疗，预防急性失代偿发生。
[关键词]枫糖尿症;BCKDHB基因;支链氨基酸;遗传代谢病
[中图分类号]R722.1 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）05-221-02
枫糖尿症（maplC syrup urine disease，MSUD，MIM#248600），是一种罕见的常染色体隐性遗传病，以急性代谢紊乱、酮尿、癫痫、智力运动发育后或及枫糖样体味为主要特征。该病若不经及时治疗，急性代谢紊乱及脑损害可呈急性进展，常导致严重脑损伤，且致死、致残率极高。据国外文献报道，枫糖尿症发病率约为1：18000，我国发病率尚不明确。本文就一例经基因诊断明确的中国枫糖尿症患儿的诊疗经过、基因突变特点进行研究，并结合文献进行分析。
1资料与方法
1.1一般资料患儿，男，为第1胎，于胎龄39周顺产出生，出生体重3500g，Apgar评分1分钟9分，5分钟10分。患儿为母乳喂养，于生后6天出现反应差及呕吐，呕吐物为胃内容物，呕吐约一天3-4次，为非喷射性，和进食无关，于呕吐后肢体抽搐发作并意识丧失。于当地医院查血常规示白细胞计数22x109/L，中性粒细胞比例78%，血红蛋白102g/L;血生化：钾2.3mmol/L，钠119mmol/L，氯91mmol/L，碳酸氢根14.2mmol/L;血气pH 7.12;肝肾功能、血脂、血糖、免疫等化验无异常。采用串联质谱查血亮氨酸屏亮氨酸539.10umol/L（正常50-290umol/L）;缬氨酸294.15umol/L（正常60-290umol/L）;别异亮氨酸91.33umol/L（正常<7.70umol/L）。采用气相色谱质谱联用查尿有机酸分析示多种α-酮酸及α-羟酸水平增高。颅脑核磁（T2WI及DWI）示两双侧基底节区、脑干及小脑呈对称性高信号改变。结合患儿枫糖样体味，当地医院予“枫糖尿症，代谢性酸中毒，电解质紊乱，贫血”诊断，予限制天然蛋白建议、予低支链氨基酸配方奶粉、左卡尼汀、维生素B1、止吐、抗炎、抗感染、止惊治疗两周后癥状好转，但仍存在反应慢。患儿父母健康，无亲缘关系，父母家族中未有类似家族史。为明确疾病遗传学诱因，患儿家长来我院进行遗传分析。签署知情同意书后，采集3名家庭成员外周静脉血2-3mL，乙二胺四乙酸抗凝，置4℃冰箱备用。
1.2方法使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，离心柱型）提取患儿及父母外周血白细胞DNA。对患儿DNA进行全外显子测序检查（安捷伦V6），原始测序数据量为5G，平均测序深度约为100x，Q30均大于95%。比对参考基因组（bg19）后，除去PCR重复，并将部分原始结果重新排列。检出变异并进行过滤后.采用annovar进行变异注释。由于临床已确诊，故先关注枫糖尿症相关基因，并明确BCKDHB基因疑似致病突变位点。
检出疑似致病位点后，由NCBI网站下载BCKDHB基因DNA全序列（NM 000.056）。采用Primer5软件设计聚合酶链反应引物，对患儿家系DNA进行扩增。胶回收以及纯化后，采用双向测序法进行基因序列分析，然后与标准序列进行比对分析。利用NCBI蛋白数据库和Bioedit软件进行人类和不同物种的BCKDHB蛋白同源序列比较，并运用MutalaonTaster软件（http：//www.mutationtaster.org）及Polyphen-2软件（http：//genetms.bwh.harvard.edu/pph2）进行突变的致病性预测。
2结果
患儿存在c.767A>C（p.Y256C）及c.1037A>G（p.Q346R）复合杂合突变，家系分析示突变源于患儿父母，符合枫糖尿症诊断。突变均为已报道突变，在千人基因组计划资料库（www.1000genomes.org）中未检出。上述突变经MutationTaster和Polyphen-2软件致病性预测为“可能致病：经多物种同源性分析示256号及346号氨基酸在多物种间高度保守（图1），结合既往文献，考虑该两个突变致病的可能性大。
3讨论
枫糖尿症是线粒体支链。α-酮酸脱氢酶缺陷引发的遗传代谢病。由于支链氨基酸及支链酮酸在患儿体内积聚，可影响大脑乙酰胆碱酯酶活性、引起大脑氧化损伤、干扰大脑能量代谢、影响髓磷脂合成、另脑细胞内外渗透压改变，进而引发代谢性脑病、脑水肿，及髓鞘形成障碍。同时，患儿体内蓄积的代谢产物表现为枫糖样体味。
根据残存酶活性，将枫糖尿症分为5种亚型，经典型、间歇型、中间型、维生素B1有效型及二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶（E3）缺乏型。其中，经典型最为常见。新生儿起病的患儿常为经典型，大多数于出生时无明显异常，于生后一周内出现喂养困难、反应差、嗜睡等症状，可出现枫糖样体味。若不及时治疗，则病情大都进展迅速，出现进一步神经系统损伤，可表现为痉挛性瘫痪、癫痫、昏迷等症状，病情严重时颅脑核磁可有脑白质海绵状变性该病，急性期可出现脑水肿，致死率及致残率极高。本文患儿临床经过典型，于生后6天以反应差、呕吐及抽搐起病，后昏迷，疾病进展迅速，考虑为经典型枫糖尿症。 枫糖尿症可经典型临床症状、生化及影像学异常、遗传学缺陷进行诊断，特异性的生化异常为枫糖尿症的快速诊断提供可能。生化异常包括血液氨基酸、酰基肉碱谱的支链氨基酸水平增高，以及尿液α-酮酸、α一羟酸的蓄积改变。血液串联质谱检查是新生儿筛查的方法之一，在多个发达国家，及我国部分地区已得以开展，并检出多种遗传代谢病患儿，包括枫糖尿症。和大多数遗传代谢病相似，枫糖尿症的病因在于毒性物质在体内的蓄积，故早筛查，早阻断毒性物质沉积，与疾病的转归和预后极为相关。枫糖尿症可通过限制毒性产物上游物质摄入及补充相应辅酶进行治疗，部分症状可治愈或缓解，颅脑损伤在一定情况下也可逆，但预后差异较大。除饮食及药物治疗外.因支链α-酮酸脱氢酶缺陷在肝脏中表达，故近年来肝移植在枫糖尿症的治疗中取得了一定疗效，血支链氨基酸水平可下降至正常。虽本文患儿未经血串联质谱进行新生儿筛查，但确诊及时，并在新生儿期及时限制天然蛋白摄入并补充祛支链氨基酸配方奶粉，给予左卡尼汀及维生素B1治疗，并行纠正电解质紊乱、止惊、止吐、纠酸、补液等对症治疗后，呕吐、抽搐及电解质紊乱得以纠正，但仍存在反应差的现象，且未复查颅脑核磁明确脑损伤变化，需长时间随访以明确其预后。
因枫糖尿症与支链α-酮酸脱氢酶相关，而支链α-酮酸脱氢酶由4个亚单位，E1α，E1β，E2及E3組成，每个亚单位异常都会引发枫糖尿症发生。故该病可由4种基因异常引发，分别是BCKDHA，BCKDHB，DLD及DBT，其中，BCKDHA基因缺陷最为常见。虽然4种基因缺陷均可引发枫糖尿症发生，但目前研究考虑BCKDHA及BCKDHB基因缺陷与经典型枫糖尿症更为相关，而DBT基因缺陷患者症状常较BCKDHA及BCKDHB基因缺陷患者轻，多与维生素B1有效型相关。本研究检出编码支链α-酮酸脱氢酶E1βB亚单位的BCKDHB基因复合杂合突变。该基因编码位于6号染色体上，编码的E1β亚单位由392个氨基酸组成。迄今已发现115个致病突变（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac）。在美国部分枫糖尿症患者中BCKDHA基因c.1312T>A为热点突变，BCKDHB基因尚未有相关热点突变的报道。本文研究的突变均为已知突变，且仅在中国患者申报道过，不排除上述突变在中国人群特异突变的可能。两个突变在物种间保守，并经预测软件预测致病可能性大，结合临床表现可予患者遗传学确诊。
本研究报道一例枫糖尿症患儿，以呕吐、枫糖样体味及抽搐为主要表现，并明确了遗传学诱因。建议对不明原因的代谢性酸中毒、代谢性脑病及特殊体味的患儿，尤其颅脑核磁有枫糖尿症特异性改变的患儿，应结合.临床特征、血液生化等鉴别诊断，争取基因分析协助确诊，并及时通过限制相关饮食、补充特殊奶粉及相应辅酶进行治疗，预防急性失代偿发生。