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[摘 要] 目的 INH异烟肼耐药性的方法。方法 应用聚合酶链反 应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测50株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。 运用DNA测序和生物信息分析比对进行验证结果。以H37Rv标准株为对照，5株药物敏感株的R FLP分析结果均与标准株一致，不存在突变；45株耐INH分离株中，31株(68.88%)RFLP分析 存在基因异常。结论 西安地区结核杆菌临床分离株对INH耐药与katG基因 (尤其是315位密码子)突变有关，PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对INH的耐 药性。
[关键词] 结核分枝杆菌 耐药 基因突变 katG 基因
[中图分类号] R378.911 [文献标识码] A [文章编号] 1009- 6019-(2011)02-08-03
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人类严重传染病，近年来由于耐多药结核菌的出现与扩 散以及艾滋病的广泛传播，造成结核病的广泛流行。据资料统计，全球已有600万人受到了 耐药结核分枝杆菌的感染，我国每年新发耐多药结核病患者12万例[1]。异烟肼(IN H)是临床常用的一线抗结核药物，国内外均已发现结核分枝杆菌对INH的耐药性日益严重 [2.3]。结核分枝杆菌对其耐药的分子机制涉及多个基因，其中主要是通过过氧化氢 酶-过氧化物酶的编码基因(katG)序列突变所致[3.4]。本实验通过聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法，对西安地区结核杆菌临床分离株耐INH与katG基 因突变的关系进行研究，建立快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法。
1 材料与方法
1.1 标本来源 50株结核分枝杆菌临床分离株来源于西安市结核病医院， 已按常规进行药敏试验；结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于中国疾病预防控制中心，由西安 市结核病医院细菌室培养并保存。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用北京TIANGEN公司细菌基因组提取试剂盒提取基因 组，－20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 根据结核分支杆菌katG基因序列(GenBank：x68081)设 计引物，由于结核杆菌katG基因编码的315位氨基酸密码子最易于产生突变，因此，我们设 计针对结核杆菌katG基因进行PCR特异性扩增的引物1对，PCR产物覆盖katG基因的315位密码 子。设计扩增产物长度为193bp具体序列如下：正向引物：5′-GAGCAGATGGGCTTGGG-3′，反 向引物：5′-CGTCCTTGGCGGTGTATT-3′引物由北京奥科公司合成。在50霯反应体系中，DNA 模板5霯，上下游引物各1霯，ddH[2]O18霯，2×PCR MasterMix 25霯。PCR循 环参数如下94℃预变性3m分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次 ，最后72℃延伸5分钟。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，在193bp处出现明显条带即为扩增 阳性。
1.2.3 PCR-RFLP分析 取7靗PCR产物，2.0靗10譌astDigest Green B uffer酶切缓冲液，1.5靗 Fast Digest enzyme限制性内切酶MspⅠ(MBI公司产品)，19.5 靗去离子水，混匀后置37℃保温5min。katG基因扩增片段经酶切消化后，行2%琼脂糖凝胶 电泳，无315位密码子突变的菌株被消化后可出现148bp片段。若发生突变，则增加1个酶切 位点，酶消化后电泳可见较小的128bp片段。
1.2.4 序列测定 挑选RFLP分析中泳动条带正常与异常的菌株各1例，取 其PCR扩增产物，送北京奥科生物技术有限责任公司进行序列测定。测序结果与H37Rv标准株 进行BLAST分析[5]。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌临床分离株药敏试验 通过药敏表型检测发现，50株临 床分离结核分枝杆菌中5株为INH敏感株，45株为INH耐药株，其中9(20%)株对INH单耐药，15 (33.33%)株为耐多药，21(46.66%)株为多耐药。
2.2 PCR扩增 50株临床分离株及H37Rv标准株基因扩增后，H37Rv标准株和 50株临床分离株均得到长度为193bp的片段(图1)
1 50bp DNA Ladder；2～11 样本PCR产物；12 阴性对照
图1 katG基因PCR产物琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of katG PCR products
2.3 RFLP分析 以H37Rv标准株为对照，5株敏感株与标准株一致，均被限 制性内切酶MspⅠ消化为3个较小片段，电泳可见1条条带，大小约为148bp，6bp和39bp片段 由于过小故不可见。45株耐药株中，14株与标准株一致，而有31株被MspⅠ消化成4个片段， 电泳可见1条条带，大小约为128bp，6bp、20bp、39bp片段由于过小故不可见。占全部耐药 菌株的68.88%(图2)。
1 50bp DNA Ladder；2 H37Rv标准株酶切结果；
3、4、7、8 野生型；5、6 突变型
图2 katG基因PCR产物RFLP分析
Fig.2 RFLP analyses of katG PCR products
2.4 序列测定 RFLP分析中出现异常泳动带的突变标本，其katG基因315位 氨基酸密码子第2位碱基发生点突变由AGC突变为ACC，与文献报道的突变位点一致。SSCP和R FLP分析中未见异常动带的标本，其序列比对与标准株相同。
3 讨论
INH是酰肼类化学合成药物，其抗结核作用主要是抑制结核菌DNA的合成，阻碍细菌细胞壁的 合成，同时也能抑制分枝菌酸(mycolic acid)的合成，使细菌丧失耐酸性、疏水性和增殖力 而死亡。
KatG基因位于结核分枝杆菌的染色体上，其表达的过氧化氢酶-过氧化物酶是一种既有过氧 化氢酶活性又有过氧化物酶活性的热稳定的酶，在INH作用中起关键作用。过氧化氢酶-过氧 化物酶可能在细胞内将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，参与辅酶Ⅰ的合成，使其不 能起同工酶的作用，抑制细菌细胞壁分枝菌酸的合成。使保护分枝杆菌抵抗氧化和侵袭的屏 障受到损害。若KatG缺失或突变，使过氧化氢酶-过氧化物酶活性丧失或降低，阻止INH转换 成活性形式，就会导致耐INH。近年的研究表明，KatG基因完全缺失不是细菌耐药的主要原 因，KatG基因突变才是导致细菌产生耐药性主要分子机制。在耐药性相关的基因突变中，以 315位密码子突变的检出率最高[6、7]。
本研究采用PCR-RFLP等方法[8]，对西安地区结核分枝杆菌INH耐药基因KatG进行了 检测和分析。本研究结果显示，临床INH耐药现象已非常普遍，且耐多药株比例比较高，单 独只对INH耐药的菌株很少。50株临床分离株中，5株敏感株RFLP分析均与标准株一致，没有 发生变异。而45株INH耐药株中，有31株RFLP分析异常，结果提示其变异存在于KatG基因315 位密码子AGC→ACC类型突变。本次试验中45株耐药分离株中RFLP检测突变率为68.88%，与 文献报道略高[9]。本研究提示西安地区的结核杆菌临床分离株对INH耐药与KatG基 因突变有关，尤其是315位密码子的突变占了很大比例。经挑选特异菌株测序后证实，突变 发生在KatG基因315位密码子的第2位碱基，其突变形式为AGC(Ser)→ACC(Thr)，验证了RFLP 结果的可靠性。
传统的药敏试验对结核分枝杆菌的检测时间长(4～8周)，不能及时有效指导临床用药。DNA 测序操作复杂，成本较高。PCR-RFLP可分析特定基因位点的点突变，具有高度的特异性。本 次实验采用的方法简单易行，成本较低，并且显著缩短了实验周期(1～2天)，弥补了常规药 敏试验的不足，是快速鉴定结核分枝杆菌INH耐药性的有效工具。
4 参考文献
[1]唐神结.耐药结核病防治手册[M].人民卫生出版社，2009：3
[2]Barnes PF，Cave MD.Molecular epidemiology of tuberculosis [J].NE ngl J Med，2003，349(12)：1149[3]Brit ton WJ，Palendira U.Improving vaccines against t uberculosis[J].Immunol Cel Biol，2003，81(1)：34
[4]Morris S，Bai GH，Suffys P，et al.Molecular mechanisms of multipledrug resistance in clinical isolates of M.tuberculosis [J].J ID，1995，171 ：954
[5]Millar BC，Xu J ，Moore J E.Molecular diagnostics of medically impo rtant bacterial infections [J].Curr Issues Mol Biol 2007，9(1)：21
[6]Abal AT，Ahmad S，Mokaddas E ，et al .Variations in t he occurrenceof t he S315 T mutation wit hin t he kat G gene in isoniazid2resistant clinicalMycobacterium tuberculosis isolates f rom Kuwait [J].Microb Drug Resis，2002 ，8(2)：99-
[7]Millar BC ，Xu J ，Moore J E.Molecular diagnostics of medically imp ortant bacterial infections [J] Curr Issues Mol Biol，2007 ，9(1)：21
[8]王倩，闰忠芳，黄淑萍，等.我国结核病耐药状况及其变化趋势分析[J]. 中国药房，2007，18(2)：93
[9]梁雅萍，黄治俊.结核耐药性现状调查及分析[J].实用医技杂志，2005，1 2(9)：2456
[收稿日期：2011-01-20]
[关键词] 结核分枝杆菌 耐药 基因突变 katG 基因
[中图分类号] R378.911 [文献标识码] A [文章编号] 1009- 6019-(2011)02-08-03
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人类严重传染病，近年来由于耐多药结核菌的出现与扩 散以及艾滋病的广泛传播，造成结核病的广泛流行。据资料统计，全球已有600万人受到了 耐药结核分枝杆菌的感染，我国每年新发耐多药结核病患者12万例[1]。异烟肼(IN H)是临床常用的一线抗结核药物，国内外均已发现结核分枝杆菌对INH的耐药性日益严重 [2.3]。结核分枝杆菌对其耐药的分子机制涉及多个基因，其中主要是通过过氧化氢 酶-过氧化物酶的编码基因(katG)序列突变所致[3.4]。本实验通过聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法，对西安地区结核杆菌临床分离株耐INH与katG基 因突变的关系进行研究，建立快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法。
1 材料与方法
1.1 标本来源 50株结核分枝杆菌临床分离株来源于西安市结核病医院， 已按常规进行药敏试验；结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于中国疾病预防控制中心，由西安 市结核病医院细菌室培养并保存。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用北京TIANGEN公司细菌基因组提取试剂盒提取基因 组，－20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 根据结核分支杆菌katG基因序列(GenBank：x68081)设 计引物，由于结核杆菌katG基因编码的315位氨基酸密码子最易于产生突变，因此，我们设 计针对结核杆菌katG基因进行PCR特异性扩增的引物1对，PCR产物覆盖katG基因的315位密码 子。设计扩增产物长度为193bp具体序列如下：正向引物：5′-GAGCAGATGGGCTTGGG-3′，反 向引物：5′-CGTCCTTGGCGGTGTATT-3′引物由北京奥科公司合成。在50霯反应体系中，DNA 模板5霯，上下游引物各1霯，ddH[2]O18霯，2×PCR MasterMix 25霯。PCR循 环参数如下94℃预变性3m分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次 ，最后72℃延伸5分钟。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，在193bp处出现明显条带即为扩增 阳性。
1.2.3 PCR-RFLP分析 取7靗PCR产物，2.0靗10譌astDigest Green B uffer酶切缓冲液，1.5靗 Fast Digest enzyme限制性内切酶MspⅠ(MBI公司产品)，19.5 靗去离子水，混匀后置37℃保温5min。katG基因扩增片段经酶切消化后，行2%琼脂糖凝胶 电泳，无315位密码子突变的菌株被消化后可出现148bp片段。若发生突变，则增加1个酶切 位点，酶消化后电泳可见较小的128bp片段。
1.2.4 序列测定 挑选RFLP分析中泳动条带正常与异常的菌株各1例，取 其PCR扩增产物，送北京奥科生物技术有限责任公司进行序列测定。测序结果与H37Rv标准株 进行BLAST分析[5]。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌临床分离株药敏试验 通过药敏表型检测发现，50株临 床分离结核分枝杆菌中5株为INH敏感株，45株为INH耐药株，其中9(20%)株对INH单耐药，15 (33.33%)株为耐多药，21(46.66%)株为多耐药。
2.2 PCR扩增 50株临床分离株及H37Rv标准株基因扩增后，H37Rv标准株和 50株临床分离株均得到长度为193bp的片段(图1)
1 50bp DNA Ladder；2～11 样本PCR产物；12 阴性对照
图1 katG基因PCR产物琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of katG PCR products
2.3 RFLP分析 以H37Rv标准株为对照，5株敏感株与标准株一致，均被限 制性内切酶MspⅠ消化为3个较小片段，电泳可见1条条带，大小约为148bp，6bp和39bp片段 由于过小故不可见。45株耐药株中，14株与标准株一致，而有31株被MspⅠ消化成4个片段， 电泳可见1条条带，大小约为128bp，6bp、20bp、39bp片段由于过小故不可见。占全部耐药 菌株的68.88%(图2)。
1 50bp DNA Ladder；2 H37Rv标准株酶切结果；
3、4、7、8 野生型；5、6 突变型
图2 katG基因PCR产物RFLP分析
Fig.2 RFLP analyses of katG PCR products
2.4 序列测定 RFLP分析中出现异常泳动带的突变标本，其katG基因315位 氨基酸密码子第2位碱基发生点突变由AGC突变为ACC，与文献报道的突变位点一致。SSCP和R FLP分析中未见异常动带的标本，其序列比对与标准株相同。
3 讨论
INH是酰肼类化学合成药物，其抗结核作用主要是抑制结核菌DNA的合成，阻碍细菌细胞壁的 合成，同时也能抑制分枝菌酸(mycolic acid)的合成，使细菌丧失耐酸性、疏水性和增殖力 而死亡。
KatG基因位于结核分枝杆菌的染色体上，其表达的过氧化氢酶-过氧化物酶是一种既有过氧 化氢酶活性又有过氧化物酶活性的热稳定的酶，在INH作用中起关键作用。过氧化氢酶-过氧 化物酶可能在细胞内将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，参与辅酶Ⅰ的合成，使其不 能起同工酶的作用，抑制细菌细胞壁分枝菌酸的合成。使保护分枝杆菌抵抗氧化和侵袭的屏 障受到损害。若KatG缺失或突变，使过氧化氢酶-过氧化物酶活性丧失或降低，阻止INH转换 成活性形式，就会导致耐INH。近年的研究表明，KatG基因完全缺失不是细菌耐药的主要原 因，KatG基因突变才是导致细菌产生耐药性主要分子机制。在耐药性相关的基因突变中，以 315位密码子突变的检出率最高[6、7]。
本研究采用PCR-RFLP等方法[8]，对西安地区结核分枝杆菌INH耐药基因KatG进行了 检测和分析。本研究结果显示，临床INH耐药现象已非常普遍，且耐多药株比例比较高，单 独只对INH耐药的菌株很少。50株临床分离株中，5株敏感株RFLP分析均与标准株一致，没有 发生变异。而45株INH耐药株中，有31株RFLP分析异常，结果提示其变异存在于KatG基因315 位密码子AGC→ACC类型突变。本次试验中45株耐药分离株中RFLP检测突变率为68.88%，与 文献报道略高[9]。本研究提示西安地区的结核杆菌临床分离株对INH耐药与KatG基 因突变有关，尤其是315位密码子的突变占了很大比例。经挑选特异菌株测序后证实，突变 发生在KatG基因315位密码子的第2位碱基，其突变形式为AGC(Ser)→ACC(Thr)，验证了RFLP 结果的可靠性。
传统的药敏试验对结核分枝杆菌的检测时间长(4～8周)，不能及时有效指导临床用药。DNA 测序操作复杂，成本较高。PCR-RFLP可分析特定基因位点的点突变，具有高度的特异性。本 次实验采用的方法简单易行，成本较低，并且显著缩短了实验周期(1～2天)，弥补了常规药 敏试验的不足，是快速鉴定结核分枝杆菌INH耐药性的有效工具。
4 参考文献
[1]唐神结.耐药结核病防治手册[M].人民卫生出版社，2009：3
[2]Barnes PF，Cave MD.Molecular epidemiology of tuberculosis [J].NE ngl J Med，2003，349(12)：1149[3]Brit ton WJ，Palendira U.Improving vaccines against t uberculosis[J].Immunol Cel Biol，2003，81(1)：34
[4]Morris S，Bai GH，Suffys P，et al.Molecular mechanisms of multipledrug resistance in clinical isolates of M.tuberculosis [J].J ID，1995，171 ：954
[5]Millar BC，Xu J ，Moore J E.Molecular diagnostics of medically impo rtant bacterial infections [J].Curr Issues Mol Biol 2007，9(1)：21
[6]Abal AT，Ahmad S，Mokaddas E ，et al .Variations in t he occurrenceof t he S315 T mutation wit hin t he kat G gene in isoniazid2resistant clinicalMycobacterium tuberculosis isolates f rom Kuwait [J].Microb Drug Resis，2002 ，8(2)：99-
[7]Millar BC ，Xu J ，Moore J E.Molecular diagnostics of medically imp ortant bacterial infections [J] Curr Issues Mol Biol，2007 ，9(1)：21
[8]王倩，闰忠芳，黄淑萍，等.我国结核病耐药状况及其变化趋势分析[J]. 中国药房，2007，18(2)：93
[9]梁雅萍，黄治俊.结核耐药性现状调查及分析[J].实用医技杂志，2005，1 2(9)：2456
[收稿日期：2011-01-20]