【摘 要】
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目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc3
【机 构】
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军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850;烟台大学药学院,山东烟台 264005;解放军总医院第五医学中心,北京 1000
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目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc35c1敲除细胞对的抗毒效应差异.结果 测序结果显示sgRNA成功插入载体质粒中,T7E1酶切结果表明两对sgRNA均可高效切割基因组DNA.RT-qPCR及基因组PCR产物测序鉴定出Slc35c1敲除的纯合子细胞株.CCK-8实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除Slc35c1使毒素作用NIH/3T3细胞24 h的IC50值由0.45×10-10 mol/L升至2.1×10-10 mol/L.结论 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除了NIH/3T3细胞中的Slc35c1基因并筛选获得纯合子细胞株,该细胞株可用于抗蓖麻毒素效应的研究.
其他文献
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目的 探讨PDCA护理干预对脑卒中合并吞咽障碍患者病耻感和生活质量的影响.方法 选取2019年3月至2020年10月大连市第五人民医院收治的126例脑卒中吞咽功能障碍患者,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组各63例.对照组接受日常康复训练模式,观察组采用PDCA护理康复训练模式.干预6周后比较两组的吞咽功能、病耻感、生活质量.结果 干预前,两组的吞咽功能、病耻感及生活质量评分比较,差异无统计学意义(P＞0.05);干预后观察组的吞咽功能及病耻感评分低于对照组,生活质量评分高于对照组,差异均有统计学意
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