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摘 要 从构建的辣椒cDNA文库中筛选阳性克隆，测序并获得辣椒CaDREB3基因，研究该基因的亚细胞定位、瞬时表达及组织表达特性，揭示CaDREB3的功能及其在植物抗逆过程中的分子机制。应用预测软件对其进行功能及生物信息学分析，利用qRT-PCR分析CaDREB3基因的瞬时表达及在不同组织中的表达特性，并以基因枪轰击洋葱表皮的方法，对CaDREB3基因进行亚细胞定位分析。结果表明，辣椒CaDREB3长度为1 997 bp，含有1071bp的完整的开放阅读框，编码357个氨基酸，含有ERF亚族的AP2/ERF保守结构域，与西红柿（NP_001234707.1）、马铃薯（AET99101.1）及拟南芥（NP_177931.1）具有较高的氨基酸相似性，其中与西红柿的相似性最高，达83%。亚细胞定位表明该基因位于细胞核，瞬时表达表明CaDREB3可以和GCC-box结合，qRT-PCR检测表明， CaDREB3基因的相对表达量在辣椒茎、叶和果实中表达量较高。实验明确了辣椒CaDREB3基因亚细胞定位信息和组织表达情况，为进一步研究其功能及分子机制提供依据。
关键词 辣椒；CaDREB3；亚细胞定位；瞬时表达；荧光定量RT-PCR
中图分类号 Q781 文献标识码 A
在植物中广泛存在ERFs转录因子家族成员，ERFs家族成员包含有1个AP2/ERF保守结构域，该结构域包含约60～70个氨基，根据该结构域第14位和19位氨基酸残基的不同，可以将ERFs家族分为ERF亚家族和DREB亚家族。DREB亚家族成员的AP2/ERF保守结构域在第14位和19位分别为缬氨酸和谷氨酸，区别于ERF的丙氨酸和天冬氨酸。同时DREB转录因子序列中含有一段Ser/Thr区域，研究表明该序列在基因互作中起到重要作用[1]。
Sakuma[2]根据转录因子因结构及功能上的不同，将DREBs亚族转录因子分为A1～A6六个亚组。迄今为止在植物中发现并深入研究的主要是DREB1（A1）和DREB2（A2）两大类[3]。该两类转录因子都能够识别DRE（含有A/GCCGAC）顺式作用元件，在植物抵抗非生物胁迫如低温、干旱和高盐过程中具有重要的作用[4]。Hong等[5]在辣椒中克隆的CaDREBLP1能够在干旱及盐胁迫下诱导表达；Chen等[6]研究表明，转基因GmDREB2大豆能够增强作物抗旱及抗盐能力；Liu等[7]研究发现转基因PpDREB1烟草能够增强抗盐、抗旱及抗低温的能力。Wang等[8]的研究结果表明柠条CkDREB基因不仅在干旱、高盐及低温下诱导表达，同时能够在ABA处理下诱导表达。而DREB2类转录因子在生物功能上表现出了比DREB1类转录因子更多样化，在拟南芥中发现的DREB2A、DEB2B基因不仅在干旱、高盐及低温下诱导表达，同时能够在热激胁迫下诱导表达[9-11]。
除了DREB1和DREB2类转录因子，研究表明其他DREB亚组基因在应答逆境胁迫和提高植物抗性上起到一定的作用。A3亚组ABI4基因在ABA和糖信号途径中具有特殊的作用[12-13]；A4亚组基因同DEEB1类基因相关，过量表达TINY和HARDY[14-15]导致植株生长矮化且叶片浓密；A5亚组基因含有一个保守的EAR（ERF-associated amphiphilic repression）基序[16-17]，转基因DREB1A或DREB2A CA诱导其上调表达[18-19]；A6亚组RAP2.4和RAP2.4B基因能够在干旱、高温及高盐下诱导表达，RAP2.4和RAP2.4B还分别应答低温和热激胁迫[20-21]。
辣椒（Capsicum annuum L.）作为一种世界上重要的蔬菜种类和工业加工原料，在其整个生育时期随时都会受到外界环境胁迫。现阶段生态环境破坏，常规防治手段效果不明显反而有时会进一步造成环境恶化，进入恶性循环。在此背景条件下，了解作物抗逆机制，以生物技术及基因工程技术入手，结合常规育种手段，以期选育获得抗逆性强的品种及控制品种优良性状的目的。本研究从辣椒cDNA文库中筛选获得了一个全长cDNA序列，对其进行了生物信息学分析，暂时命名为CaDREB3。采用基因枪法明确CaDREB3的亚细胞定位信息，及其与顺式作用元件瞬间表达分析，利用实时荧光PCR技术检测了该基因在辣椒不同组织中的表达水平，为进一步深入研究CaDREB3基因的功能提供参考，为研究辣椒DREB转录因子介导的抗逆机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
采用福建本地辣椒品种8#材料，构建辣椒叶片cDNA文库，挑选阳性克隆测序。
1.2 方法
基因克隆与序列分析：随机挑取cDNA文库阳性克隆，以M13R为测序引物，测序。利用NCBI和DNAMAN软件，分析基因序列和其开放阅读框，进行Blastn序列比对。利用Prosite 数据库、SMART和WOLF PSORT分别查找功能结构域位点、分析蛋白结构与功能并预测亚细胞定位；利用ClustalX分析分子进化，利用Mega4.1构建系统发育树。
载体构建：采用Gateway技术。以pDONR207作为入门载体，构建亚细胞定位目的载体pMDC83、瞬间表达分析报告载体pBT10-GUS-GCC和pBT10-GUS-CRT/DRE。载体构建引物如表1。
采用基因枪轰击洋葱表皮法进行瞬间表达分析[22]；在荧光显微镜下观察亚细胞定位并采集图像；利用RT-PCR分析辣椒根、茎、叶、花及果实等组织特异性表达[23]，以actin基因作为内参基因（表2）。
2 结果与分析
2.1 辣椒CaDREB3基因全长cDNA的分離
阳性克隆测序后将EST片段进行分子比对表明：基因全长为1 997 bp，分子量39.214 ku，含有1 071 bp的完整的开放阅读框，编码357个氨基酸（图1）；Blastp显示该基因与西红柿SlDREB3（NP_001234707.1）氨基酸序列相似度最高为83%，与马铃薯StDREB4（AET99101.1）及拟南芥RAP2.4（NP_177931.1）氨基酸序列相似度均达到47%以上，因此，初步将该基因命名为CaDREB3（图1）。 2.2 辣椒CaDREB3基因保守結构域及系统进化分析
蛋白结构域分析表明，在AP2/ERF结构域第14位和19位为区别于ERF亚族特有的缬氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb亚族特有，同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2（图2）。利用MEGA4.0将辣椒CaDREB3与西红柿及马铃薯等37个氨基酸相似序列进行比对，构建系统进化树（图3）。结果表明，辣椒CaDREB3与西红柿及马铃薯相关DREB基因同源性最高，在76%以上，同属于ERF家族Ⅰb（A6）亚族。
2.3 CaDREB3基因组织特异性表达分析
组织表达模式分析结果显示，在辣椒茎、叶片和果实中CaDREB3均有表达，在根和花中没有表达。在茎中的表达量最高，而叶片中的表达量次之（图4）。
2.4 CaDREB3与GCC-box、CRT/DRE顺式元件结合能力分析
基因枪轰击洋葱表皮细胞，以空载体为阴性对照，分析基因瞬时表达，结果表明该基因能够与GCC-box盒发生互作，与DRE顺式元件不能互作（图5）。
2.5 CaDREB3亚细胞定位分析
首先利用WOLF PSORT预测CaDREB3的亚细胞定位信息，结果表明，CaDREB3有可能位于细胞核上。CaDREB3-GFP融合蛋白和空载体通过基因枪轰击洋葱表皮，在荧光显微镜下观察CaDREB3融合蛋白的亚细胞定位情况。结果发现，空载体分布于整个细胞中，而CaDREB3融合蛋白位于细胞核上（图6）。
3 讨论
DREB和ERF是AP2/EREBP转录因子家族中重要的两个亚族，在抵抗环境和生物、非生物胁迫方面都具有重要的作用。已有研究表明，DREB在抵抗低温、高盐及干旱等非生物胁迫方面具有重要的作用[4]，并且能够应答ABA激素信号。
本研究从辣椒cDNA文库中挑选阳性克隆，测序并获得了辣椒CaDREB3基因编码区序列。分析CaDREB3基因保守结构域发现，在第14位和第19位是DREB亚族特有的缬氨酸和亮氨酸。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb（A6）亚组特有，研究发现该亚族基因玉米DBF1能够激活干旱应答因子2（DRE2），提高植物抗旱能力[24]。同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2，过量表达蒺藜苜蓿MtWXP1可以提高蜡的含量，而WXP1蛋白含有Ⅰb亚族中所有的保守序列[25]。根据Ⅰb（A6）亚组多种植物在抗非生物胁迫上表现，推测CaDREB3可能存在相类似的功能。
大量研究表明DREB转录因子能够特异结合DRE顺式元件，从而激活目的基因的表达。而且不同的DREB蛋白可以结合不同的DRE核心序列（ACCGAC和GCCGAC），表明DREB转录因子作用机制的复杂性。而本实验瞬时表达结果显示CaDREB3可以和GCC-box顺式元件相结合，而不能与DRE元件结合，表明CaDREB3可能应答生物胁迫，以调节病程相关（PR）基因的表达。CaDREB3不能够与CRT/DRE顺式元件相结合，或许CaDREB3不能够应答非生物胁迫，或在生物及非生物胁迫间具有某种交叉信号途经。DREB家族Ⅰb（A6）亚族基因数量不多且功能研究较少，CaDREB3作为其中一员，其功能研究的进一步开展对于该亚族基因在植物中的相关作用具有重要意义。同时序列分析表明CaDREB3不含有EAR元件，暗示了该基因在植物胁迫应答反应中的某种激活机制。
通过WOLF PSORT预测结果表明CaDREB3 可能定位于细胞核上，而亚细胞定位试验结果表明，CaDREB3定位于细胞核上。因此可以初步判定CaDREB3定位于细胞核上。
综上所述，CaDREB3作为Ⅰb（A6）亚族一员，由于迄今为止对该亚族基因的功能还不太清楚，同时CaDREB3表现出能够特异结合GCC-box盒，而不是DRE序列，说明该基因功能及其作用机制都具有一定的不确定性，需要进一步的试验对其考证并探索DREB的作用原理。
4 结论
本研究成功克隆了辣椒CaDREB3基因，全长1 997 bp，其含有1 071 bp的完整的开放阅读框，编码357个氨基酸，在AP2/ERF结构域第14位和19位为DREB亚族特有的缬氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb亚族特有，同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2序列。实时荧光定量PCR检测结果表明，CaDREB3基因在茎中表达量大幅升高，在叶和果实的表达量也有上升。CaDREB3蛋白主要定位于细胞核中，能够与GCC-box盒相结合，不能同DRE元件结合。本研究结果为进一步研究CaDREB3蛋白的生物学功能提供了基础数据，为研究DREB类转录因子的功能提供了新的候选基因。
参考文献
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关键词 辣椒；CaDREB3；亚细胞定位；瞬时表达；荧光定量RT-PCR
中图分类号 Q781 文献标识码 A
在植物中广泛存在ERFs转录因子家族成员，ERFs家族成员包含有1个AP2/ERF保守结构域，该结构域包含约60～70个氨基，根据该结构域第14位和19位氨基酸残基的不同，可以将ERFs家族分为ERF亚家族和DREB亚家族。DREB亚家族成员的AP2/ERF保守结构域在第14位和19位分别为缬氨酸和谷氨酸，区别于ERF的丙氨酸和天冬氨酸。同时DREB转录因子序列中含有一段Ser/Thr区域，研究表明该序列在基因互作中起到重要作用[1]。
Sakuma[2]根据转录因子因结构及功能上的不同，将DREBs亚族转录因子分为A1～A6六个亚组。迄今为止在植物中发现并深入研究的主要是DREB1（A1）和DREB2（A2）两大类[3]。该两类转录因子都能够识别DRE（含有A/GCCGAC）顺式作用元件，在植物抵抗非生物胁迫如低温、干旱和高盐过程中具有重要的作用[4]。Hong等[5]在辣椒中克隆的CaDREBLP1能够在干旱及盐胁迫下诱导表达；Chen等[6]研究表明，转基因GmDREB2大豆能够增强作物抗旱及抗盐能力；Liu等[7]研究发现转基因PpDREB1烟草能够增强抗盐、抗旱及抗低温的能力。Wang等[8]的研究结果表明柠条CkDREB基因不仅在干旱、高盐及低温下诱导表达，同时能够在ABA处理下诱导表达。而DREB2类转录因子在生物功能上表现出了比DREB1类转录因子更多样化，在拟南芥中发现的DREB2A、DEB2B基因不仅在干旱、高盐及低温下诱导表达，同时能够在热激胁迫下诱导表达[9-11]。
除了DREB1和DREB2类转录因子，研究表明其他DREB亚组基因在应答逆境胁迫和提高植物抗性上起到一定的作用。A3亚组ABI4基因在ABA和糖信号途径中具有特殊的作用[12-13]；A4亚组基因同DEEB1类基因相关，过量表达TINY和HARDY[14-15]导致植株生长矮化且叶片浓密；A5亚组基因含有一个保守的EAR（ERF-associated amphiphilic repression）基序[16-17]，转基因DREB1A或DREB2A CA诱导其上调表达[18-19]；A6亚组RAP2.4和RAP2.4B基因能够在干旱、高温及高盐下诱导表达，RAP2.4和RAP2.4B还分别应答低温和热激胁迫[20-21]。
辣椒（Capsicum annuum L.）作为一种世界上重要的蔬菜种类和工业加工原料，在其整个生育时期随时都会受到外界环境胁迫。现阶段生态环境破坏，常规防治手段效果不明显反而有时会进一步造成环境恶化，进入恶性循环。在此背景条件下，了解作物抗逆机制，以生物技术及基因工程技术入手，结合常规育种手段，以期选育获得抗逆性强的品种及控制品种优良性状的目的。本研究从辣椒cDNA文库中筛选获得了一个全长cDNA序列，对其进行了生物信息学分析，暂时命名为CaDREB3。采用基因枪法明确CaDREB3的亚细胞定位信息，及其与顺式作用元件瞬间表达分析，利用实时荧光PCR技术检测了该基因在辣椒不同组织中的表达水平，为进一步深入研究CaDREB3基因的功能提供参考，为研究辣椒DREB转录因子介导的抗逆机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
采用福建本地辣椒品种8#材料，构建辣椒叶片cDNA文库，挑选阳性克隆测序。
1.2 方法
基因克隆与序列分析：随机挑取cDNA文库阳性克隆，以M13R为测序引物，测序。利用NCBI和DNAMAN软件，分析基因序列和其开放阅读框，进行Blastn序列比对。利用Prosite 数据库、SMART和WOLF PSORT分别查找功能结构域位点、分析蛋白结构与功能并预测亚细胞定位；利用ClustalX分析分子进化，利用Mega4.1构建系统发育树。
载体构建：采用Gateway技术。以pDONR207作为入门载体，构建亚细胞定位目的载体pMDC83、瞬间表达分析报告载体pBT10-GUS-GCC和pBT10-GUS-CRT/DRE。载体构建引物如表1。
采用基因枪轰击洋葱表皮法进行瞬间表达分析[22]；在荧光显微镜下观察亚细胞定位并采集图像；利用RT-PCR分析辣椒根、茎、叶、花及果实等组织特异性表达[23]，以actin基因作为内参基因（表2）。
2 结果与分析
2.1 辣椒CaDREB3基因全长cDNA的分離
阳性克隆测序后将EST片段进行分子比对表明：基因全长为1 997 bp，分子量39.214 ku，含有1 071 bp的完整的开放阅读框，编码357个氨基酸（图1）；Blastp显示该基因与西红柿SlDREB3（NP_001234707.1）氨基酸序列相似度最高为83%，与马铃薯StDREB4（AET99101.1）及拟南芥RAP2.4（NP_177931.1）氨基酸序列相似度均达到47%以上，因此，初步将该基因命名为CaDREB3（图1）。 2.2 辣椒CaDREB3基因保守結构域及系统进化分析
蛋白结构域分析表明，在AP2/ERF结构域第14位和19位为区别于ERF亚族特有的缬氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb亚族特有，同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2（图2）。利用MEGA4.0将辣椒CaDREB3与西红柿及马铃薯等37个氨基酸相似序列进行比对，构建系统进化树（图3）。结果表明，辣椒CaDREB3与西红柿及马铃薯相关DREB基因同源性最高，在76%以上，同属于ERF家族Ⅰb（A6）亚族。
2.3 CaDREB3基因组织特异性表达分析
组织表达模式分析结果显示，在辣椒茎、叶片和果实中CaDREB3均有表达，在根和花中没有表达。在茎中的表达量最高，而叶片中的表达量次之（图4）。
2.4 CaDREB3与GCC-box、CRT/DRE顺式元件结合能力分析
基因枪轰击洋葱表皮细胞，以空载体为阴性对照，分析基因瞬时表达，结果表明该基因能够与GCC-box盒发生互作，与DRE顺式元件不能互作（图5）。
2.5 CaDREB3亚细胞定位分析
首先利用WOLF PSORT预测CaDREB3的亚细胞定位信息，结果表明，CaDREB3有可能位于细胞核上。CaDREB3-GFP融合蛋白和空载体通过基因枪轰击洋葱表皮，在荧光显微镜下观察CaDREB3融合蛋白的亚细胞定位情况。结果发现，空载体分布于整个细胞中，而CaDREB3融合蛋白位于细胞核上（图6）。
3 讨论
DREB和ERF是AP2/EREBP转录因子家族中重要的两个亚族，在抵抗环境和生物、非生物胁迫方面都具有重要的作用。已有研究表明，DREB在抵抗低温、高盐及干旱等非生物胁迫方面具有重要的作用[4]，并且能够应答ABA激素信号。
本研究从辣椒cDNA文库中挑选阳性克隆，测序并获得了辣椒CaDREB3基因编码区序列。分析CaDREB3基因保守结构域发现，在第14位和第19位是DREB亚族特有的缬氨酸和亮氨酸。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb（A6）亚组特有，研究发现该亚族基因玉米DBF1能够激活干旱应答因子2（DRE2），提高植物抗旱能力[24]。同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2，过量表达蒺藜苜蓿MtWXP1可以提高蜡的含量，而WXP1蛋白含有Ⅰb亚族中所有的保守序列[25]。根据Ⅰb（A6）亚组多种植物在抗非生物胁迫上表现，推测CaDREB3可能存在相类似的功能。
大量研究表明DREB转录因子能够特异结合DRE顺式元件，从而激活目的基因的表达。而且不同的DREB蛋白可以结合不同的DRE核心序列（ACCGAC和GCCGAC），表明DREB转录因子作用机制的复杂性。而本实验瞬时表达结果显示CaDREB3可以和GCC-box顺式元件相结合，而不能与DRE元件结合，表明CaDREB3可能应答生物胁迫，以调节病程相关（PR）基因的表达。CaDREB3不能够与CRT/DRE顺式元件相结合，或许CaDREB3不能够应答非生物胁迫，或在生物及非生物胁迫间具有某种交叉信号途经。DREB家族Ⅰb（A6）亚族基因数量不多且功能研究较少，CaDREB3作为其中一员，其功能研究的进一步开展对于该亚族基因在植物中的相关作用具有重要意义。同时序列分析表明CaDREB3不含有EAR元件，暗示了该基因在植物胁迫应答反应中的某种激活机制。
通过WOLF PSORT预测结果表明CaDREB3 可能定位于细胞核上，而亚细胞定位试验结果表明，CaDREB3定位于细胞核上。因此可以初步判定CaDREB3定位于细胞核上。
综上所述，CaDREB3作为Ⅰb（A6）亚族一员，由于迄今为止对该亚族基因的功能还不太清楚，同时CaDREB3表现出能够特异结合GCC-box盒，而不是DRE序列，说明该基因功能及其作用机制都具有一定的不确定性，需要进一步的试验对其考证并探索DREB的作用原理。
4 结论
本研究成功克隆了辣椒CaDREB3基因，全长1 997 bp，其含有1 071 bp的完整的开放阅读框，编码357个氨基酸，在AP2/ERF结构域第14位和19位为DREB亚族特有的缬氨酸和亮氨酸，并含有一段保守的WLG序列。在N-末端含有保守的的CMⅠ-3和CMⅠ-4序列，为ERF家族Ⅰb亚族特有，同时在C-末端含有保守序列CMⅠ-1和CMⅠ-2序列。实时荧光定量PCR检测结果表明，CaDREB3基因在茎中表达量大幅升高，在叶和果实的表达量也有上升。CaDREB3蛋白主要定位于细胞核中，能够与GCC-box盒相结合，不能同DRE元件结合。本研究结果为进一步研究CaDREB3蛋白的生物学功能提供了基础数据，为研究DREB类转录因子的功能提供了新的候选基因。
参考文献
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