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摘要：综述了在3R运动和体外科学技术的推动下，各国替代方法在化学品及化妆品毒性测试中的验证和法规认可现状。讨论了替代方法在皮肤刺激、眼刺激、皮肤致敏、全身毒性、遗传/生殖/发育毒性等毒理学终点的应用。最后提出，生物安全评价作为医疗器械的重要评价指标，医疗器械的动物替代方法也将成为趋势，上述替代方法均可尝试在医疗器械的生物安全评价中使用。
关键词：医疗器械 替代方法
【中图分类号】R197.39 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）11-01
自1959年Russel和Burch发表《人道实验技术原理》一书中第一次提3R（reduce、refine、replace）理论以来，尤其从2013年3月11日起，欧盟委员会下令全面禁止用动物对化妆品的安全性测试和销售，包括化妆品成分。以减少、优化和替代为核心的动物试验替代方法已经被愈来愈多的的科学家所接受，在实际研究工作中得到了广泛的应用。医疗器械作为人类生活的必需品，保证其临床使用的安全越来越受到各国政府和学术界的重视。因此，在医疗器械领域减少动物的使用，甚至完全替代动物试验也将是一種趋势。那么开发和研究适用于医疗器械安全性评价的体外替代方法势在必行。本文就可用于医疗器械生物学评价的替代方法做一简述，为开发和研究适用于我国医疗器械安全评价替代方法提供参考。
1 世界各国动物实验禁令现状
欧盟于2013年3月全面禁止化妆品动物实验并禁止销售经过动物测试的化妆品，同时要求成员国禁止进口违反上述禁令的化妆品。
除了欧盟以外，挪威在2013年与欧盟同步禁止了化妆品的动物试验。以色列自2007年5月起禁止化妆品、个人护理用品和洗涤剂进行动物实验，2013年1月实施销售禁令。2014年5月印度开始禁止使用动物进行化妆品测试，自2014年11月起禁止进口经动物检测的化妆品。澳大利亚于2014年和2016年先后提出终止残忍议案，从2017年起禁止实施化妆品动物试验及销售经过动物试验测试的化妆品。2015年新西兰开始禁止化妆品及成分在研发、生产、测试、教学中使用动物试验。2017年巴西在2014年禁止化妆品动物试验法案基础上进行的修改，禁止成品和原料的动物试验。2018年韩国全面禁止成品和原料的动物试验。自2019年开始中国台湾省禁止化妆品成品及原料的动物试验。零残忍化妆品测试法规已成为全球趋势。
2 在医疗器械生物安全评价中的应用
在以欧盟为代表的化学品和化妆品动物实验禁令的实施，各国政府及学术界均投入大量人力物力开发替代方法，同时验证机构、标准化组织和监管机构也加快了替代方法的认可速度，多项替代方法已获认可或已向经济合作与发展组织（OECD）提交草案的方法，还有很多新的方法正在开发和验证的程序中[1～2]。
医疗器械生物安全性评价目前涉及的项目除细菌内毒素试验、细胞毒性试验、溶血试验、部分遗传毒性试验、部分血液相容性试验等项目是体外方法外，其余项目都是在动物体内进行的，因此，寻求可用的替代方法对于减少和替代动物的使用至关重要。
2.1 皮肤刺激替代方法
目前，经过OECD验证的用于皮肤腐蚀的新的替代方法包括重组人表皮模型（RHE）、体外膜屏障试验方法、大鼠经皮肤电阻试验，用于皮肤刺激的替代方法有重组人表皮模型试验。
根据ECVAM科学咨询委员会发布公告，EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic这3种组织工程皮肤模型能够根据OECD TG431操作指南来区分腐蚀性和非腐蚀性化合物，可以将其作为皮肤腐蚀性化合物检测的动物替代方法[3-4]。在2014年9月欧莱雅在中国获得人体皮肤重建模型EpiSkin的营业执照，开启了组织工程在中国的研究与应用[5]。
2.2 皮肤致敏替代方法
根据皮肤致敏的机制而设计的离体试验，包括直接多肽反应试验（DPRA），基于ARE-Nrf2通路的荧光酶试验，人细胞系活化试验（h-CLAT）。DPRA试验是利用受试物与合成的两条7肽寡肽链氨基酸（分别为半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽）在体外环境中结合，然后通过液相色谱发分析反应前后两种氨基酸曲线下面积来分析受试物与氨基酸的结合率来预测受试物的引起过敏的可能性。Masaaki[6]等利用人单核白血病细胞（THP-1）以CD86和CD54为指标建立了皮肤致敏性的体外评价体系，即人细胞系活化试验。THP-1细胞与不同浓度2，4-二硝基氯苯（DNCB）共培养24小时后，采用流式细胞术检测共刺激分子CD86与CD54表达变化，以及细胞活力与CD86/CD54表达的关系[7]。利用已知致敏剂DNCB处理后，共刺激分子CD86与CD54表达都增加，而非致敏剂DMSO和SLS处理后观察不到此变化[8]。
2.3 全身毒性替代方法
全身毒性包括急性、亚急性、亚慢性和慢性全身毒性。OECD于 2010 年正式发布“利用细胞毒性试验预测急性毒性经口毒性试验初始剂量”的指导原则。ECVAM提出正常人角质细胞或Balb/c 3T3细胞中性红摄取试验可以用于确定急性毒性起始剂量。曾丽海[9-10]研究也显示BALB/c 3T3 细胞中性红摄取试验能够较好地预测急性毒性。除此之外，OECD于2001年发布了3种急性经口实验替代方法的最新修订版，并于2002年废除了传统的实验方法，我国则于2008年将上述方法接纳为化学品检验国家标准。谭剑斌[11]等采用3种替代法（固定剂量法、急性毒性分级法和上下法）与传统实验方法的比较，参照OECD TG423进行，研究结果与传统实验方法间具有较高一致性和相关性，且此3种方法所使用的动物比传统方法明显减少，因此他认为这3种方法具有取代传统检测方法的潜力。
其余全身毒性试验尚无验证的替代方法。步犁等[12]认为有些化学物虽然急性毒性作用极低，却有可能亚慢性或慢性毒性.如某些重金属、氢醌、苯胺类、肽酸酯类等，因此查明受试物（如化妆品）中可能含有的具有慢性毒性作用的化学物，评估其反复接触后产生的健康风险是保障化妆品消费安全的关键措施之一。 2.4 遺传/生殖/发育毒性替代方法
遗传毒性试验是采用哺乳动物或非哺乳动物细胞、细菌、酵母菌或真菌测定受试物样品是否引起基因突变、染色体结构畸变以及其他DNA或基因变化的试验，根据《GBT 16886.3-2008医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》规定，细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验和哺乳动物细胞诱裂性试验体外试验结果均为阴性，为避免动物的过度使用，通常不再论证并不宜再进行动物遗传毒性试验;若全部结果均为阳性，则应进行体内诱变性试验，否则推定该化合物为诱变物。
根据《GBT 16886.3-2008医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》规定，在确定进行生殖和发育毒性试验之前，应在评价医疗器械使用中引发生殖和发育毒性风险的基础上对进行试验的决定予以论证;对可吸收医疗器械或含可溶出物质的医疗器械，如果在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或材料或医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无生殖和发育毒性时，就无需进行生殖毒性试验;对医疗器械进行可接受的生物学风险评估后，如生殖和发育毒性的风险已被排除，则无需进行动物试验。
3 结语
医疗器械作为人类生活的必需品，保证其临床使用的安全越来越受到各国政府和学术界的重视。上述所有的国外化学品及化妆品领域应用的替代方法均可尝试在医疗器械的生物安全评价中使用。以上这些替代方法将大大节省动物资源和安全性评价投入。而我国目前还没有建立医疗器械非动物体外毒理学研究方法，无法实现与欧盟、美国、OECD等国家和国际组织先进方法的接轨。 寻求可用的医疗器械替代方法可积极响应3R的倡导，以及为我国医疗器械替代方法验证提供参考，尽量排除我国进出口贸易因动物试验而存在的技术壁垒。
参考文献：
[1] 瞿小婷，程树军，刘超，等. 《日用化学品安全评价技术创新——替代方法》专题一 国际化学品安全评价动物替代测试法规趋势[J]. 日用化学品科学. 2016（02）： 11-16.
[2]程树军.动物实验替代技术研究进展[J].科技导报，2017，，35（24）：40-47.
[3] Kandarova H， Liebsch M， Spielmann H， et al. Assessment of the human epidermis model SkinEthic RHE for in vitro skin corrosion testing of chemicals according to new OECD TG 431[J]. Toxicol In Vitro. 2006， 20（5）： 547-559.
[4] Cotovio J， Grandidier M H， Portes P， et al. The in vitro skin irritation of chemicals： optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process[J]. Altern Lab Anim. 2005， 33（4）： 329-349.
[5] 邹运动. 含有表皮层、真皮层和皮下脂肪层结构组织工程皮肤的构建[D]. 西北农林科技大学， 2008.
[6] Miyazawa M， Ito Y， Yoshida Y， et al. Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens[J]. Toxicol In Vitro. 2007， 21（3）： 428-437.
[7] 田胜慧，柯军，杨立峰，等. 一种皮肤致敏体外替代方法介绍-人细胞系激活试验[J]. 中国比较医学杂志. 2013（12）： 48-51.
[8] Yoshida Y， Sakaguchi H， Ito Y， et al. Evaluation of the skin sensitization potential of chemicals using expression of co-stimulatory molecules， CD54 and CD86， on the naive THP-1 cell line[J]. Toxicol In Vitro. 2003， 17（2）： 221-228.
[9] 曾丽海，赵敏，杨杏芬，等. 应用3T3细胞中性红摄取试验预测化学物质急性毒性的探讨[J]. 毒理学杂志. 2011（06）： 438-441.
[10] 曾丽海，黄振烈，杨杏芬，等. 人正常角化细胞中性红摄取试验预测化学品急性毒性的研究[Z]. 中国湖北武汉： 20151.
[11] 谭剑斌，赵敏，杨杏芬，等. 3种替代方法在急性经口毒性实验中应用研究[J]. 中国职业医学. 2011（S1）： 1-4.
[12] 步犁，程树军，谈伟君. 揭秘化妆品安全性评价技术（十）——慢性毒性试验及其替代方法[J]. 中国化妆品（行业）. 2012（06）： 58-64.
关键词：医疗器械 替代方法
【中图分类号】R197.39 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）11-01
自1959年Russel和Burch发表《人道实验技术原理》一书中第一次提3R（reduce、refine、replace）理论以来，尤其从2013年3月11日起，欧盟委员会下令全面禁止用动物对化妆品的安全性测试和销售，包括化妆品成分。以减少、优化和替代为核心的动物试验替代方法已经被愈来愈多的的科学家所接受，在实际研究工作中得到了广泛的应用。医疗器械作为人类生活的必需品，保证其临床使用的安全越来越受到各国政府和学术界的重视。因此，在医疗器械领域减少动物的使用，甚至完全替代动物试验也将是一種趋势。那么开发和研究适用于医疗器械安全性评价的体外替代方法势在必行。本文就可用于医疗器械生物学评价的替代方法做一简述，为开发和研究适用于我国医疗器械安全评价替代方法提供参考。
1 世界各国动物实验禁令现状
欧盟于2013年3月全面禁止化妆品动物实验并禁止销售经过动物测试的化妆品，同时要求成员国禁止进口违反上述禁令的化妆品。
除了欧盟以外，挪威在2013年与欧盟同步禁止了化妆品的动物试验。以色列自2007年5月起禁止化妆品、个人护理用品和洗涤剂进行动物实验，2013年1月实施销售禁令。2014年5月印度开始禁止使用动物进行化妆品测试，自2014年11月起禁止进口经动物检测的化妆品。澳大利亚于2014年和2016年先后提出终止残忍议案，从2017年起禁止实施化妆品动物试验及销售经过动物试验测试的化妆品。2015年新西兰开始禁止化妆品及成分在研发、生产、测试、教学中使用动物试验。2017年巴西在2014年禁止化妆品动物试验法案基础上进行的修改，禁止成品和原料的动物试验。2018年韩国全面禁止成品和原料的动物试验。自2019年开始中国台湾省禁止化妆品成品及原料的动物试验。零残忍化妆品测试法规已成为全球趋势。
2 在医疗器械生物安全评价中的应用
在以欧盟为代表的化学品和化妆品动物实验禁令的实施，各国政府及学术界均投入大量人力物力开发替代方法，同时验证机构、标准化组织和监管机构也加快了替代方法的认可速度，多项替代方法已获认可或已向经济合作与发展组织（OECD）提交草案的方法，还有很多新的方法正在开发和验证的程序中[1～2]。
医疗器械生物安全性评价目前涉及的项目除细菌内毒素试验、细胞毒性试验、溶血试验、部分遗传毒性试验、部分血液相容性试验等项目是体外方法外，其余项目都是在动物体内进行的，因此，寻求可用的替代方法对于减少和替代动物的使用至关重要。
2.1 皮肤刺激替代方法
目前，经过OECD验证的用于皮肤腐蚀的新的替代方法包括重组人表皮模型（RHE）、体外膜屏障试验方法、大鼠经皮肤电阻试验，用于皮肤刺激的替代方法有重组人表皮模型试验。
根据ECVAM科学咨询委员会发布公告，EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic这3种组织工程皮肤模型能够根据OECD TG431操作指南来区分腐蚀性和非腐蚀性化合物，可以将其作为皮肤腐蚀性化合物检测的动物替代方法[3-4]。在2014年9月欧莱雅在中国获得人体皮肤重建模型EpiSkin的营业执照，开启了组织工程在中国的研究与应用[5]。
2.2 皮肤致敏替代方法
根据皮肤致敏的机制而设计的离体试验，包括直接多肽反应试验（DPRA），基于ARE-Nrf2通路的荧光酶试验，人细胞系活化试验（h-CLAT）。DPRA试验是利用受试物与合成的两条7肽寡肽链氨基酸（分别为半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽）在体外环境中结合，然后通过液相色谱发分析反应前后两种氨基酸曲线下面积来分析受试物与氨基酸的结合率来预测受试物的引起过敏的可能性。Masaaki[6]等利用人单核白血病细胞（THP-1）以CD86和CD54为指标建立了皮肤致敏性的体外评价体系，即人细胞系活化试验。THP-1细胞与不同浓度2，4-二硝基氯苯（DNCB）共培养24小时后，采用流式细胞术检测共刺激分子CD86与CD54表达变化，以及细胞活力与CD86/CD54表达的关系[7]。利用已知致敏剂DNCB处理后，共刺激分子CD86与CD54表达都增加，而非致敏剂DMSO和SLS处理后观察不到此变化[8]。
2.3 全身毒性替代方法
全身毒性包括急性、亚急性、亚慢性和慢性全身毒性。OECD于 2010 年正式发布“利用细胞毒性试验预测急性毒性经口毒性试验初始剂量”的指导原则。ECVAM提出正常人角质细胞或Balb/c 3T3细胞中性红摄取试验可以用于确定急性毒性起始剂量。曾丽海[9-10]研究也显示BALB/c 3T3 细胞中性红摄取试验能够较好地预测急性毒性。除此之外，OECD于2001年发布了3种急性经口实验替代方法的最新修订版，并于2002年废除了传统的实验方法，我国则于2008年将上述方法接纳为化学品检验国家标准。谭剑斌[11]等采用3种替代法（固定剂量法、急性毒性分级法和上下法）与传统实验方法的比较，参照OECD TG423进行，研究结果与传统实验方法间具有较高一致性和相关性，且此3种方法所使用的动物比传统方法明显减少，因此他认为这3种方法具有取代传统检测方法的潜力。
其余全身毒性试验尚无验证的替代方法。步犁等[12]认为有些化学物虽然急性毒性作用极低，却有可能亚慢性或慢性毒性.如某些重金属、氢醌、苯胺类、肽酸酯类等，因此查明受试物（如化妆品）中可能含有的具有慢性毒性作用的化学物，评估其反复接触后产生的健康风险是保障化妆品消费安全的关键措施之一。 2.4 遺传/生殖/发育毒性替代方法
遗传毒性试验是采用哺乳动物或非哺乳动物细胞、细菌、酵母菌或真菌测定受试物样品是否引起基因突变、染色体结构畸变以及其他DNA或基因变化的试验，根据《GBT 16886.3-2008医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》规定，细菌基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验和哺乳动物细胞诱裂性试验体外试验结果均为阴性，为避免动物的过度使用，通常不再论证并不宜再进行动物遗传毒性试验;若全部结果均为阳性，则应进行体内诱变性试验，否则推定该化合物为诱变物。
根据《GBT 16886.3-2008医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验》规定，在确定进行生殖和发育毒性试验之前，应在评价医疗器械使用中引发生殖和发育毒性风险的基础上对进行试验的决定予以论证;对可吸收医疗器械或含可溶出物质的医疗器械，如果在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或材料或医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无生殖和发育毒性时，就无需进行生殖毒性试验;对医疗器械进行可接受的生物学风险评估后，如生殖和发育毒性的风险已被排除，则无需进行动物试验。
3 结语
医疗器械作为人类生活的必需品，保证其临床使用的安全越来越受到各国政府和学术界的重视。上述所有的国外化学品及化妆品领域应用的替代方法均可尝试在医疗器械的生物安全评价中使用。以上这些替代方法将大大节省动物资源和安全性评价投入。而我国目前还没有建立医疗器械非动物体外毒理学研究方法，无法实现与欧盟、美国、OECD等国家和国际组织先进方法的接轨。 寻求可用的医疗器械替代方法可积极响应3R的倡导，以及为我国医疗器械替代方法验证提供参考，尽量排除我国进出口贸易因动物试验而存在的技术壁垒。
参考文献：
[1] 瞿小婷，程树军，刘超，等. 《日用化学品安全评价技术创新——替代方法》专题一 国际化学品安全评价动物替代测试法规趋势[J]. 日用化学品科学. 2016（02）： 11-16.
[2]程树军.动物实验替代技术研究进展[J].科技导报，2017，，35（24）：40-47.
[3] Kandarova H， Liebsch M， Spielmann H， et al. Assessment of the human epidermis model SkinEthic RHE for in vitro skin corrosion testing of chemicals according to new OECD TG 431[J]. Toxicol In Vitro. 2006， 20（5）： 547-559.
[4] Cotovio J， Grandidier M H， Portes P， et al. The in vitro skin irritation of chemicals： optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process[J]. Altern Lab Anim. 2005， 33（4）： 329-349.
[5] 邹运动. 含有表皮层、真皮层和皮下脂肪层结构组织工程皮肤的构建[D]. 西北农林科技大学， 2008.
[6] Miyazawa M， Ito Y， Yoshida Y， et al. Phenotypic alterations and cytokine production in THP-1 cells in response to allergens[J]. Toxicol In Vitro. 2007， 21（3）： 428-437.
[7] 田胜慧，柯军，杨立峰，等. 一种皮肤致敏体外替代方法介绍-人细胞系激活试验[J]. 中国比较医学杂志. 2013（12）： 48-51.
[8] Yoshida Y， Sakaguchi H， Ito Y， et al. Evaluation of the skin sensitization potential of chemicals using expression of co-stimulatory molecules， CD54 and CD86， on the naive THP-1 cell line[J]. Toxicol In Vitro. 2003， 17（2）： 221-228.
[9] 曾丽海，赵敏，杨杏芬，等. 应用3T3细胞中性红摄取试验预测化学物质急性毒性的探讨[J]. 毒理学杂志. 2011（06）： 438-441.
[10] 曾丽海，黄振烈，杨杏芬，等. 人正常角化细胞中性红摄取试验预测化学品急性毒性的研究[Z]. 中国湖北武汉： 20151.
[11] 谭剑斌，赵敏，杨杏芬，等. 3种替代方法在急性经口毒性实验中应用研究[J]. 中国职业医学. 2011（S1）： 1-4.
[12] 步犁，程树军，谈伟君. 揭秘化妆品安全性评价技术（十）——慢性毒性试验及其替代方法[J]. 中国化妆品（行业）. 2012（06）： 58-64.