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【摘要】 目的 采用高血糖条件下SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,通过观察大鼠脑梗死体积、细胞间粘附分子的表达情况,探讨预防性应用拜阿司匹灵对高血糖条件下SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的脑保护作用。方法 随机分为对照组与拜阿司匹灵组,两组按缺血90 min再灌注3 h、6 h、12 h再分为3个亚组。各组均建立高血糖模型及SD大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。分别测量梗死体积,免疫组化方法测定ICAM 1的表达情况。结果 拜阿司匹灵组与对照组相同再灌注时间点相比较:梗死体积减小(P均<0.01);缺血区ICAM 1表达减少(P均<0.01)。结论 预防性应用拜阿司匹灵能减轻高血糖条件下的局灶性脑缺血再灌注损伤,缩小梗死体积,使损伤脑区ICAM 1表达减少。
【关键词】拜阿司匹灵;高血糖;脑缺血再灌注;ICAM 1
Effect of bay aspirin on ICAM 1 on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat with hyperlycemia
SONG Ni Na,GAO Zheng,SUN Wen Fang,et al.The North Hospital of Dalian Medical University No.2 Affiliated Hospital,Dalian 116031,China
【Abstract】 Objective Applying focal ischemia reperfusion model of SD rat on the condition of hyperglycemia,to obserrve cerebral infarction volume of rat and expression of intercellular adhesion molecule 1 to discuss protective effect of pretreatment ofbay aspirin on the condition of hyperglycemia.Methods SD rat were randomly divided into two groups,control group and bay aspirin group.Each groupwas divided into three subgroups according to reperfusion 3 h、6 h and 24 h after ischemia for 90 minutes.Establish hyperglycemia model and ischemia reperfusion model in right cerebral middle artery of SD rat.Measuring the infarction volume and observing the expression of ICAM 1 with immunohistological method.Results Comparison between bay aspirin group and control group at the same point of time,infarction volume decreased,P<0.01,and ICAM 1 at the ischemia area decreased,P<0.01.Conclusion Under condition of hyperglycemia,preventive pretreatment by bay aspirin can decrease focal ischemia reperfusion damage,reduce infarction volume,reduce the expression of ICAM 1.
【Key words】 Bay aspirin; Ischemia reperfusion; Hyperglycemia; ICAM 1
脑缺血再灌注损伤是目前治疗缺血性脑血管病的靶点和热点问题,缺血性脑血管病急性期的高血糖使其临床转归更差。阿司匹林在缺血性脑血管病的治疗及二级预防中的保护作用已得到肯定,对其作用机制的研究也取得较大进展;但其一级预防作用尚未肯定,特别是在高血糖情况下其一级预防作用,至今尚无研究。本研究旨在通过预防性应用拜阿司匹灵,观察在高血糖状态下,SD大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积、细胞间粘附分子 1(ICAM 1)的表达情况,并探讨高血糖状态下,拜阿司匹灵预处理后对大鼠脑缺血再灌注损伤是否有保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠共36只,体质量180~220 g,血糖正常(〈6 mmol/l〉,术前禁食12 h。按随机化原理分为两组:对照组(n=18)、拜阿司匹灵(n=18),各组按缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分为3个亚组。
1.2 实验方法
1.2.1 给药方法 拜阿司匹灵组大鼠在手术前3 d灌胃,剂量为6 mg/kg体质量。
1.2.2 制备大鼠高血糖模型,栓线前血糖值>11.1 mmol/l表示高血糖模型建立成功。
1.2.3 制备大鼠大脑中动脉(MCA)闭塞的脑缺血再灌注模型 参照改良的 Longa Zea氏线栓法[1]制作大鼠大脑中动脉梗阻再灌注模型。模型成功的标志为动物苏醒后出现同侧的Horner征(眼裂变小,眼球内陷)和对侧以前肢为重的偏瘫。于栓塞90 min拔出栓线,分别于再灌注后3 h、6 h、24 h(每个亚组6只)处死动物。
1.3 观察指标
1.3.1 脑梗死体积的测定 采用病理图像分析仪系统测定并计算出梗死体积/大脑体积百分比,以此作统计分析数据。
1.3.2 SP免疫组织化学法测定ICAM 1的表达,计数ICAM 1阳性微血管数。
1.4 统计学方法 所有数据均以(x±s)表示,应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。两组间的比较采用成组t检验。P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 脑梗死体积测定 在相同再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组脑梗死体积明显降低(P<0.01)。(见表1)。
表1
脑梗死体积在各组再灌注各时间点的比较(梗死体积/总体积百分比)
组别3 h6 h24 h
对照组15.21±0.8518.85±1.0823.26±0.85
拜阿司匹灵组12.03±1.46△△15.11±0.95△△19.52±1.47△△
2.2 免疫组化结果 ICAM 1阳性反应主要以梗死灶及其周围区域的微血管为主,表现为血管壁的棕黄色深染。在相同再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组ICAM 1阳性表达明显降低(P<0.01)。(见表2)。
表2
ICAM 1在各组再灌注各时间点的表达结果
组别3 h6 h24 h
对照组30.33±1.6336.33±2.1640.17±1.47
拜阿司匹灵组24.50±1.52△△29.17±3.87△△36.00±2.67△△
注:拜阿司匹灵组与对照组各时间点比较,△表示 P<0.05,△△表示P<0.01
3 讨论
拜阿司匹灵是临床常用药。在血糖正常状态下,其在脑缺血再灌注中的神经保护作用机制可能是通过如下途径:①提高PGI2/TXA2;②减少自由基产生,改善能量代谢;③抑制炎症介质和细胞因子等介导的炎症反应[2];④减轻兴奋性氨基酸毒性;⑤抑制细胞内钙升高。高血糖能加重脑缺血损伤,无氧酵解使细胞乳酸过多堆积而发生酸中毒,加重神经细胞和神经胶质细胞的损害。此外高血糖还能通过增加缺血脑组织一氧化氮和中性白细胞浸润,通过炎症反应加重脑缺血再灌注损伤[3]。目前高血糖状态下,拜阿司匹灵是否也具有神经保护作用尚不明确。
本研究发现,在高血糖状态下,在相同的再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组梗死体积明显减小。脑梗死体积的大小是判断脑损伤程度的客观可靠的指标,因此可以通过观察ICAM 1的表达探讨拜阿司匹灵在高血糖状态下,减小梗死体积,减轻脑损伤的分子机制。
在正常情况下,细胞间粘附有利于机体的防御反应。但在脑缺血再灌注时,局部血管内皮细胞以及白细胞表面黏附分子数量及功能均显著上调,细胞黏附性加强[4]。一方面会机械性堵塞微循环通道,导致微血管闭塞引发“无复流”现象[5];另一方面,活化的白细胞可释放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶,损害局部的血管,导致血管通透性加强,造成组织水肿。进入组织的白细胞可进一步释放一些炎性介质和细胞因子,加重炎性反应,形成恶性循环,直到组织完全破坏。白细胞浸润及血管源性水肿加重了脑缺血损伤,其间涉及多种粘附分子,较重要的是ICAM 1(CD 54)。ICAM 1属于免疫球蛋白基因超家族,主要分布于血管内皮细胞表面,参与细胞间粘附过程,主要介导单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及激活内皮细胞[6]。正常血糖水平,采用沙土鼠全脑缺血再灌注模型发现,阿司匹林干预能够抑制ICAM 1的表达水平而获得较好的脑保护作用[7]。本研究发现,在再灌注各时间点,拜阿司匹灵组较对照组ICAM 1表达明显减少,具有统计学意义。由此证实在高血糖状态下,拜阿司匹灵也可以抑制ICAM 1的表达,通过减轻炎症反应,减轻了脑缺血再灌注损伤,甚至可能减轻高血糖损害,仍然起到了神经保护作用。
参考文献
[1] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20(1):84 91.
[2] Cuesta E,Boada J,Perales JC,et al.Aspirin inhibits NF kappaB activation in a glycolysis depleted lung epithelial cell line.Eur J Pharmacol,2005,517(3):158 164.
[3] 帅杰.实验性高血糖大鼠缺血脑组织一氧化氮和中性白细胞浸润的变化.中国神经精神疾病杂志,1998,24:9 10.
[4] Stanimirovic D,Shapiro A,Wong J,et al.The induction of ICAM 1 in human cerebromicrovascular endothelial cells(HCEC)by ischemia like conditions promotes enhanced neutrophil/HCEC adhesion.J Neuro immunol,1997,76(1 2):193 205.
[5] Pantoni L,Sarti C,Inzitari D.Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology.Hagerstown,1999,18(4):503 514.
[6] Frijus CJ,Kappelle LJ.Inflammatory cell adhesion molecules ischemic cerebrovascular disease.Stroke,2002,33(8):2115 2122.
[7] 刘爽,李义召,边红,等.阿司匹林对沙土鼠脑缺血 再灌注损伤后细胞间黏附分子及降钙素基因相关肽表达的影响,中国现代神经疾病杂志,2005, 6:404 408.
【关键词】拜阿司匹灵;高血糖;脑缺血再灌注;ICAM 1
Effect of bay aspirin on ICAM 1 on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat with hyperlycemia
SONG Ni Na,GAO Zheng,SUN Wen Fang,et al.The North Hospital of Dalian Medical University No.2 Affiliated Hospital,Dalian 116031,China
【Abstract】 Objective Applying focal ischemia reperfusion model of SD rat on the condition of hyperglycemia,to obserrve cerebral infarction volume of rat and expression of intercellular adhesion molecule 1 to discuss protective effect of pretreatment ofbay aspirin on the condition of hyperglycemia.Methods SD rat were randomly divided into two groups,control group and bay aspirin group.Each groupwas divided into three subgroups according to reperfusion 3 h、6 h and 24 h after ischemia for 90 minutes.Establish hyperglycemia model and ischemia reperfusion model in right cerebral middle artery of SD rat.Measuring the infarction volume and observing the expression of ICAM 1 with immunohistological method.Results Comparison between bay aspirin group and control group at the same point of time,infarction volume decreased,P<0.01,and ICAM 1 at the ischemia area decreased,P<0.01.Conclusion Under condition of hyperglycemia,preventive pretreatment by bay aspirin can decrease focal ischemia reperfusion damage,reduce infarction volume,reduce the expression of ICAM 1.
【Key words】 Bay aspirin; Ischemia reperfusion; Hyperglycemia; ICAM 1
脑缺血再灌注损伤是目前治疗缺血性脑血管病的靶点和热点问题,缺血性脑血管病急性期的高血糖使其临床转归更差。阿司匹林在缺血性脑血管病的治疗及二级预防中的保护作用已得到肯定,对其作用机制的研究也取得较大进展;但其一级预防作用尚未肯定,特别是在高血糖情况下其一级预防作用,至今尚无研究。本研究旨在通过预防性应用拜阿司匹灵,观察在高血糖状态下,SD大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积、细胞间粘附分子 1(ICAM 1)的表达情况,并探讨高血糖状态下,拜阿司匹灵预处理后对大鼠脑缺血再灌注损伤是否有保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠共36只,体质量180~220 g,血糖正常(〈6 mmol/l〉,术前禁食12 h。按随机化原理分为两组:对照组(n=18)、拜阿司匹灵(n=18),各组按缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分为3个亚组。
1.2 实验方法
1.2.1 给药方法 拜阿司匹灵组大鼠在手术前3 d灌胃,剂量为6 mg/kg体质量。
1.2.2 制备大鼠高血糖模型,栓线前血糖值>11.1 mmol/l表示高血糖模型建立成功。
1.2.3 制备大鼠大脑中动脉(MCA)闭塞的脑缺血再灌注模型 参照改良的 Longa Zea氏线栓法[1]制作大鼠大脑中动脉梗阻再灌注模型。模型成功的标志为动物苏醒后出现同侧的Horner征(眼裂变小,眼球内陷)和对侧以前肢为重的偏瘫。于栓塞90 min拔出栓线,分别于再灌注后3 h、6 h、24 h(每个亚组6只)处死动物。
1.3 观察指标
1.3.1 脑梗死体积的测定 采用病理图像分析仪系统测定并计算出梗死体积/大脑体积百分比,以此作统计分析数据。
1.3.2 SP免疫组织化学法测定ICAM 1的表达,计数ICAM 1阳性微血管数。
1.4 统计学方法 所有数据均以(x±s)表示,应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。两组间的比较采用成组t检验。P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 脑梗死体积测定 在相同再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组脑梗死体积明显降低(P<0.01)。(见表1)。
表1
脑梗死体积在各组再灌注各时间点的比较(梗死体积/总体积百分比)
组别3 h6 h24 h
对照组15.21±0.8518.85±1.0823.26±0.85
拜阿司匹灵组12.03±1.46△△15.11±0.95△△19.52±1.47△△
2.2 免疫组化结果 ICAM 1阳性反应主要以梗死灶及其周围区域的微血管为主,表现为血管壁的棕黄色深染。在相同再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组ICAM 1阳性表达明显降低(P<0.01)。(见表2)。
表2
ICAM 1在各组再灌注各时间点的表达结果
组别3 h6 h24 h
对照组30.33±1.6336.33±2.1640.17±1.47
拜阿司匹灵组24.50±1.52△△29.17±3.87△△36.00±2.67△△
注:拜阿司匹灵组与对照组各时间点比较,△表示 P<0.05,△△表示P<0.01
3 讨论
拜阿司匹灵是临床常用药。在血糖正常状态下,其在脑缺血再灌注中的神经保护作用机制可能是通过如下途径:①提高PGI2/TXA2;②减少自由基产生,改善能量代谢;③抑制炎症介质和细胞因子等介导的炎症反应[2];④减轻兴奋性氨基酸毒性;⑤抑制细胞内钙升高。高血糖能加重脑缺血损伤,无氧酵解使细胞乳酸过多堆积而发生酸中毒,加重神经细胞和神经胶质细胞的损害。此外高血糖还能通过增加缺血脑组织一氧化氮和中性白细胞浸润,通过炎症反应加重脑缺血再灌注损伤[3]。目前高血糖状态下,拜阿司匹灵是否也具有神经保护作用尚不明确。
本研究发现,在高血糖状态下,在相同的再灌注时间点,拜阿司匹灵组较对照组梗死体积明显减小。脑梗死体积的大小是判断脑损伤程度的客观可靠的指标,因此可以通过观察ICAM 1的表达探讨拜阿司匹灵在高血糖状态下,减小梗死体积,减轻脑损伤的分子机制。
在正常情况下,细胞间粘附有利于机体的防御反应。但在脑缺血再灌注时,局部血管内皮细胞以及白细胞表面黏附分子数量及功能均显著上调,细胞黏附性加强[4]。一方面会机械性堵塞微循环通道,导致微血管闭塞引发“无复流”现象[5];另一方面,活化的白细胞可释放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶,损害局部的血管,导致血管通透性加强,造成组织水肿。进入组织的白细胞可进一步释放一些炎性介质和细胞因子,加重炎性反应,形成恶性循环,直到组织完全破坏。白细胞浸润及血管源性水肿加重了脑缺血损伤,其间涉及多种粘附分子,较重要的是ICAM 1(CD 54)。ICAM 1属于免疫球蛋白基因超家族,主要分布于血管内皮细胞表面,参与细胞间粘附过程,主要介导单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及激活内皮细胞[6]。正常血糖水平,采用沙土鼠全脑缺血再灌注模型发现,阿司匹林干预能够抑制ICAM 1的表达水平而获得较好的脑保护作用[7]。本研究发现,在再灌注各时间点,拜阿司匹灵组较对照组ICAM 1表达明显减少,具有统计学意义。由此证实在高血糖状态下,拜阿司匹灵也可以抑制ICAM 1的表达,通过减轻炎症反应,减轻了脑缺血再灌注损伤,甚至可能减轻高血糖损害,仍然起到了神经保护作用。
参考文献
[1] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20(1):84 91.
[2] Cuesta E,Boada J,Perales JC,et al.Aspirin inhibits NF kappaB activation in a glycolysis depleted lung epithelial cell line.Eur J Pharmacol,2005,517(3):158 164.
[3] 帅杰.实验性高血糖大鼠缺血脑组织一氧化氮和中性白细胞浸润的变化.中国神经精神疾病杂志,1998,24:9 10.
[4] Stanimirovic D,Shapiro A,Wong J,et al.The induction of ICAM 1 in human cerebromicrovascular endothelial cells(HCEC)by ischemia like conditions promotes enhanced neutrophil/HCEC adhesion.J Neuro immunol,1997,76(1 2):193 205.
[5] Pantoni L,Sarti C,Inzitari D.Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology.Hagerstown,1999,18(4):503 514.
[6] Frijus CJ,Kappelle LJ.Inflammatory cell adhesion molecules ischemic cerebrovascular disease.Stroke,2002,33(8):2115 2122.
[7] 刘爽,李义召,边红,等.阿司匹林对沙土鼠脑缺血 再灌注损伤后细胞间黏附分子及降钙素基因相关肽表达的影响,中国现代神经疾病杂志,2005, 6:404 408.