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纳他霉素（ N a t a m y c i n ）的化学式为C33H47NO13，分子量为665.73 ，熔点：280℃，是一种多烯大环内酯类化合物，为白色至乳白色的无臭无味的结晶粉末，微溶于水和甲醇，难溶于非极性有机溶剂；纳他霉素属于两性化合物，在酸性或者碱性溶液中溶解度增加，但稳定性会降低。纳他霉素阻遏麦角甾醇的生物合成，达到抑制真菌的作用，对细菌和病毒不具有抗菌活性。
纳他霉素可用于治疗真菌引起的疾病，在食品工业中作为防腐剂使用，具有无臭、无味，低剂量且安全性高的特点，并且不影响奶酪、生火腿的自然成熟过程。在乳制品中添加纳他霉素5～10mg/kg的量可以延长产品的货架期；肉类食品喷涂4μg/ cm2的纳他霉素即可达到有效的抑菌水平；添加纳他霉素可防止水果饮料的变质；纳他霉素还用于焙烤食品的防腐、水果蔬菜的采后贮藏等。纳他霉素无毒，不致癌、不致敏，但是很难从动物或人体的胃肠吸收。
纳他霉素的抗菌作用和安全性得到了广泛认可，目前全世界有30多个国家允许纳他霉素用于食品的生产和保藏，但是对其在食品中使用的法规标准不同。欧盟法规规定，纳他霉素仅能应用于奶酪和香肠的表面防腐处理，禁止在葡萄酒中添加纳他霉素； 美国联邦法规规定，纳他霉素可用于奶酪表面防腐处理，还可以添加到预混饲料中；我国GB2760《食品添加剂卫生标准》中对纳他霉素的使用也作出了具体规定，值得注意的是，即食类海产制品未在允许添加纳他霉素的范围内，意味着纳他霉素在即食海产品中不得检出。
根据报道纳他霉素的测定方法主要有生物法、光谱法，色谱法，质谱法等方法，生物法操作过程也比较繁琐，耗时长；分光光度法灵敏度不够，测定即食海产品干扰大；质谱法仪器成本高，检测即食海产品有基质效应；色谱法具有准确、高效、快速的特点。本论文研究高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素的含量的方法，为即食海产品中纳他霉素的检测提供技术参数。
材料与方法
仪器及材料。高效液相色谱仪：LC20A（日本岛津公司）；色谱柱：VP- ODS柱（250 mm×4.6μm，日本岛津公司）；电子分析天平（德国Sartorius 公司）；超声波提取器（上海比朗）；涡旋混合器（德国IKA公司）；超纯水系统（德国Millipore公司）；离心机（sigma公司）。
纳他霉素标准品纯度均大于98%（德国Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色谱纯，美国CNW公司）；甲酸、氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
仪器条件。流动相：甲醇：水（70：30，v/ v），等度洗脱。
流速：1.0mL/min；
色谱柱温度：35℃；
检测器：二极管阵列检测器，波长305nm；
进样量：20μL。
结果与讨论
溶剂的选择。分别用2.0%甲酸甲醇溶液、纯甲醇溶液和2.0%氨水甲醇溶液将纳他霉素配制成浓度分别0.5mg/L、5.0mg/L和50.0mg/L，上机测定三次，峰面积取平均值，结果见表1.
从表1中，看出纯甲醇作为溶剂测定的峰面积结果最高，纳他霉素浓度为0.5mg/L在不同的溶剂中峰面积差别较大，说明纳他霉素在酸性或碱性溶液中稳定性差，浓度越小，稳定性越差，从实验的结果看，纯甲醇适合作为纳他霉素的溶剂。
流动相的优化。选择甲醇-水体系作为测定纳他霉素的流动相，流速为1.0mL/min，从5.0%甲醇水溶液开始，甲醇的比例以5%递增进行测试，将5.0mg/L浓度的纳他霉素标准溶液进样20μL，发现随着甲醇比例的增加，纳他霉素保留时间减少，峰展宽变窄，峰面积的变化见图1。
从图1中，当流动相中甲醇的比例低于50%时，相同浓度下纳他霉素的响应值降低，可能的原因是，一方面由于色谱峰有前伸和拖尾的现象较严重，部分纳他霉素提前或者滞后流出，未能有效积分；另一方面甲醇比例的减少，纳他霉素在溶液体系中部分析出，残留在仪器管路内。当流动相中甲醇的比例高于50%时，相同浓度下纳他霉素的响应值较高但是变化不大，如果用50%甲醇作为流动相，出峰时间较长，不利于提高工作效率，而用纯甲醇作为流动相，出峰时间过快使得目标峰与其他杂质出峰时间相近，与杂质的分离度降低，所以选择70%甲醇作为流动相既保证了分析的效率，又保障了合适的分离效果。
样品前处理。
（1）提取试剂
选用50%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，纯甲醇进行提取纳他霉素的试剂，在即食海产品样品中添加纳他霉素标准溶液，以回收率作为指标，添加浓度为5.0mg/L，结果见表2。
表中，三种试剂提取的纳他霉素回收率在89%以上，50%甲醇水溶液提取的回收率相对偏低，70%甲醇水溶液和纯甲醇都适合作为即食海产品中纳他霉素的提取试剂，但是考虑到即食海产品中往往含有大量的脂肪色素等物质，纯甲醇会将这些杂质更充分的提取，给仪器及色谱柱带来更严重的污染，同时还浪费试剂，所以选择70%甲醇水溶液作为即食海产品中纳他霉素的提取试剂，既满足了分析的要求，并且与流动相保持了一致，减少了试剂体系的系统峰。
（2）提取方式
选用70%甲醇水溶液，用不同的提取方式提取即食海产品中的纳他霉素。取即食海产品样品粉碎，称样5.0g，加入20mL70%甲醇水溶液，超声波提取：用超声波提取器提取30min，冷却到室温，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；浸泡提取：在室温下放置10小时，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；震荡提取：震荡60min，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；结果见表3。表中表明三种方法提取的结果差别不大，但是超声波提取用时少，更能提高工作效率。
方法学验证。
（1）线性关系及检出限
配制纳他霉素的系列标准溶液浓度分别为1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L和20.0mg/L，上机测定，标准曲线图见图2。表明高效液相色谱法测定纳他霉素在1- 20mg/ L的范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9995，以基线噪声的三倍作为测定的检出限，纳他霉素的检出限为0.2mg /L。
（2）精密度及回收率
进样5.0mg/L纳他霉素标准溶液，连续进样11次计算精密度，结果见表4，高效液相色谱法测定纳他霉素的精密度为1.49%，精密度符合测定的要求。
取阴性样品，称样5.0g，分别添加成纳他霉素含量为1.0mg/kg、5.0mg/kg和20.0mg/kg的测试样品，加入20mL70%甲醇水溶液，超声波提取30min，离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定，回收率实验结果见表5。高效液相色谱法测定纳他霉素的回收率在90%以上，满足分析要求。
结论
建立了高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素含量的方法，通过比较溶剂酸化甲醇、氨化甲醇和纯甲醇，发现纯甲醇比较适合作为纳他霉素的溶剂；优化了流动相，用70%甲醇水溶液作流动相分析纳他霉素高效，分离度好；研究了前处理的提取试剂及提取方式，70%甲醇水溶液提取即食海产品中的纳他霉素得到较好的结果，提取的方式选择超声波提取法；对方法进行验证，高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素的含量的在1.0- 20mg/ L范围线性良好，相关系数为0.9995，检出限为0.2mg/L，精密度为1.49%，用该方法测定即食海产品中纳他霉素含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法测定即食海产品中纳他霉素含量的方法快速，准确，高效，可满足检测技术要求。
纳他霉素可用于治疗真菌引起的疾病，在食品工业中作为防腐剂使用，具有无臭、无味，低剂量且安全性高的特点，并且不影响奶酪、生火腿的自然成熟过程。在乳制品中添加纳他霉素5～10mg/kg的量可以延长产品的货架期；肉类食品喷涂4μg/ cm2的纳他霉素即可达到有效的抑菌水平；添加纳他霉素可防止水果饮料的变质；纳他霉素还用于焙烤食品的防腐、水果蔬菜的采后贮藏等。纳他霉素无毒，不致癌、不致敏，但是很难从动物或人体的胃肠吸收。
纳他霉素的抗菌作用和安全性得到了广泛认可，目前全世界有30多个国家允许纳他霉素用于食品的生产和保藏，但是对其在食品中使用的法规标准不同。欧盟法规规定，纳他霉素仅能应用于奶酪和香肠的表面防腐处理，禁止在葡萄酒中添加纳他霉素； 美国联邦法规规定，纳他霉素可用于奶酪表面防腐处理，还可以添加到预混饲料中；我国GB2760《食品添加剂卫生标准》中对纳他霉素的使用也作出了具体规定，值得注意的是，即食类海产制品未在允许添加纳他霉素的范围内，意味着纳他霉素在即食海产品中不得检出。
根据报道纳他霉素的测定方法主要有生物法、光谱法，色谱法，质谱法等方法，生物法操作过程也比较繁琐，耗时长；分光光度法灵敏度不够，测定即食海产品干扰大；质谱法仪器成本高，检测即食海产品有基质效应；色谱法具有准确、高效、快速的特点。本论文研究高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素的含量的方法，为即食海产品中纳他霉素的检测提供技术参数。
材料与方法
仪器及材料。高效液相色谱仪：LC20A（日本岛津公司）；色谱柱：VP- ODS柱（250 mm×4.6μm，日本岛津公司）；电子分析天平（德国Sartorius 公司）；超声波提取器（上海比朗）；涡旋混合器（德国IKA公司）；超纯水系统（德国Millipore公司）；离心机（sigma公司）。
纳他霉素标准品纯度均大于98%（德国Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色谱纯，美国CNW公司）；甲酸、氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
仪器条件。流动相：甲醇：水（70：30，v/ v），等度洗脱。
流速：1.0mL/min；
色谱柱温度：35℃；
检测器：二极管阵列检测器，波长305nm；
进样量：20μL。
结果与讨论
溶剂的选择。分别用2.0%甲酸甲醇溶液、纯甲醇溶液和2.0%氨水甲醇溶液将纳他霉素配制成浓度分别0.5mg/L、5.0mg/L和50.0mg/L，上机测定三次，峰面积取平均值，结果见表1.
从表1中，看出纯甲醇作为溶剂测定的峰面积结果最高，纳他霉素浓度为0.5mg/L在不同的溶剂中峰面积差别较大，说明纳他霉素在酸性或碱性溶液中稳定性差，浓度越小，稳定性越差，从实验的结果看，纯甲醇适合作为纳他霉素的溶剂。
流动相的优化。选择甲醇-水体系作为测定纳他霉素的流动相，流速为1.0mL/min，从5.0%甲醇水溶液开始，甲醇的比例以5%递增进行测试，将5.0mg/L浓度的纳他霉素标准溶液进样20μL，发现随着甲醇比例的增加，纳他霉素保留时间减少，峰展宽变窄，峰面积的变化见图1。
从图1中，当流动相中甲醇的比例低于50%时，相同浓度下纳他霉素的响应值降低，可能的原因是，一方面由于色谱峰有前伸和拖尾的现象较严重，部分纳他霉素提前或者滞后流出，未能有效积分；另一方面甲醇比例的减少，纳他霉素在溶液体系中部分析出，残留在仪器管路内。当流动相中甲醇的比例高于50%时，相同浓度下纳他霉素的响应值较高但是变化不大，如果用50%甲醇作为流动相，出峰时间较长，不利于提高工作效率，而用纯甲醇作为流动相，出峰时间过快使得目标峰与其他杂质出峰时间相近，与杂质的分离度降低，所以选择70%甲醇作为流动相既保证了分析的效率，又保障了合适的分离效果。
样品前处理。
（1）提取试剂
选用50%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，纯甲醇进行提取纳他霉素的试剂，在即食海产品样品中添加纳他霉素标准溶液，以回收率作为指标，添加浓度为5.0mg/L，结果见表2。
表中，三种试剂提取的纳他霉素回收率在89%以上，50%甲醇水溶液提取的回收率相对偏低，70%甲醇水溶液和纯甲醇都适合作为即食海产品中纳他霉素的提取试剂，但是考虑到即食海产品中往往含有大量的脂肪色素等物质，纯甲醇会将这些杂质更充分的提取，给仪器及色谱柱带来更严重的污染，同时还浪费试剂，所以选择70%甲醇水溶液作为即食海产品中纳他霉素的提取试剂，既满足了分析的要求，并且与流动相保持了一致，减少了试剂体系的系统峰。
（2）提取方式
选用70%甲醇水溶液，用不同的提取方式提取即食海产品中的纳他霉素。取即食海产品样品粉碎，称样5.0g，加入20mL70%甲醇水溶液，超声波提取：用超声波提取器提取30min，冷却到室温，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；浸泡提取：在室温下放置10小时，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；震荡提取：震荡60min，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定；结果见表3。表中表明三种方法提取的结果差别不大，但是超声波提取用时少，更能提高工作效率。
方法学验证。
（1）线性关系及检出限
配制纳他霉素的系列标准溶液浓度分别为1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L和20.0mg/L，上机测定，标准曲线图见图2。表明高效液相色谱法测定纳他霉素在1- 20mg/ L的范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9995，以基线噪声的三倍作为测定的检出限，纳他霉素的检出限为0.2mg /L。
（2）精密度及回收率
进样5.0mg/L纳他霉素标准溶液，连续进样11次计算精密度，结果见表4，高效液相色谱法测定纳他霉素的精密度为1.49%，精密度符合测定的要求。
取阴性样品，称样5.0g，分别添加成纳他霉素含量为1.0mg/kg、5.0mg/kg和20.0mg/kg的测试样品，加入20mL70%甲醇水溶液，超声波提取30min，离心10分钟，取上层溶液过0. 22 μm 滤膜，上机测定，回收率实验结果见表5。高效液相色谱法测定纳他霉素的回收率在90%以上，满足分析要求。
结论
建立了高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素含量的方法，通过比较溶剂酸化甲醇、氨化甲醇和纯甲醇，发现纯甲醇比较适合作为纳他霉素的溶剂；优化了流动相，用70%甲醇水溶液作流动相分析纳他霉素高效，分离度好；研究了前处理的提取试剂及提取方式，70%甲醇水溶液提取即食海产品中的纳他霉素得到较好的结果，提取的方式选择超声波提取法；对方法进行验证，高效液相色谱法测定即食海产品中纳他霉素的含量的在1.0- 20mg/ L范围线性良好，相关系数为0.9995，检出限为0.2mg/L，精密度为1.49%，用该方法测定即食海产品中纳他霉素含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法测定即食海产品中纳他霉素含量的方法快速，准确，高效，可满足检测技术要求。