目的建立聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,PEG-rh G-CSF)平均修饰度的高效液相色谱蒸发光散射(high performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection,HPLC-ELSD)检测方法,并进行验证。方法采用Jupiter 5u C4 300A色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以含0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液为A流动相,含0.1%TFA的乙腈为B流动相,流速1 mL/min,在35℃柱温条件下经分段线性洗脱的方式分离样品,蒸发光散射检测器漂移管温度90℃,载气流速2.0 L/min,用外标法和双对数校正曲线定量溶液中的游离PEG含量。采用蛋白酶K消化去除PEG-rhG-CSF的蛋白部分后,经相同方法测定溶液中的总PEG含量,并计算结合PEG的含量和PEG的平均修饰度。对方法的专属性、线性、精密性、准确性进行验证,并确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。结果本实验建立的HPLC-ELSD法可将PEG与PEG-rh G-CSF及其他辅料成分有效分离;PEG在50~400μg/mL范围内,上样量对数值与相应峰面积对数值之间呈良好的线性关系,拟合回归方程为:Y=1.969 X+0.652,r~2=0.999;精密性试验RSD为1.9%;LOD和LOQ分别为66和109μg/mL;PEG的平均回收率为98.1%。结论本实验建立的方法具有良好的专属性、精密度及准确性,可用于测定PEG-rh G-CSF的平均修饰度。