【摘 要】
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目的 构建钙网织蛋白(CRT)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,并检测其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT表达的影响.方法 设计CRT特异性靶序列,合成含有靶序列的线性化载体pSIH1-H1-c
【机 构】
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赣州市人民医院耳鼻咽喉头颈外科,江西 赣州 3410000
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目的 构建钙网织蛋白(CRT)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,并检测其对喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT表达的影响.方法 设计CRT特异性靶序列,合成含有靶序列的线性化载体pSIH1-H1-copGFP,通过转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2筛选基因表达效率最高的靶序列.包装生产CRT-shRNA慢病毒并测定滴度,转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测重组慢病毒载体对CRT基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果.结果 PCR阳性鉴定及测序分析结果 显示,插入片段的序列及方向均与预期结果 一致.含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siRNA3的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的表达量均低于空白对照组(P﹤0.05).含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2的载体转染喉鳞状细胞癌细胞Hep-2的基因表达效率均低于CRT siRNA3(P﹤0.05).经测定,慢病毒载体的滴度为3.5×107 TU/ml,感染复数(MOI)=30时慢病毒转染至Hep-2细胞的转染率在90％以上.实时PCR结果 显示,shRNA组中CRT基因的表达水平低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05).Western blot结果 显示,与空白对照组和阴性对照组相比,shRNA组喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT蛋白的表达水平明显下降.结论 成功构建针对CRT的重组慢病毒载体可有效抑制喉鳞状细胞癌细胞Hep-2中CRT的表达,为后续研究CRT基因的功能提供了实验工具.
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