论文部分内容阅读
摘要：红果番茄GF基因位点的绿果肉（green-flesh，gf）突变体有gf、gf2、gf3、gf4、gf5共5种等位基因，因其特殊的果实颜色而受到大众喜爱。笔者调查发现，gf位点突变体具有抗番茄褪绿病毒病的功能，但有些棕果番茄并不是gf位点突变体。从300份候选材料中选取6份棕果番茄材料，并以易感褪绿病毒的番茄红果材料‘T2015-47’为对照，以gf位点特异引物进行检测。试验结果表明，‘T2016-33’不能酶切出109 bp和57 bp的特异条带，为gf基因突变体；‘2012-2’酶切出187 bp和171 bp的特异条带，为gf2基因突变体；‘T2015-66’和‘T2016-32’酶切出216 bp和18 bp的特異条带，为gf4基因突变体。建立了利用分子标记快速准确鉴定出棕果番茄是否为gf位点突变体的方法，为选育抗褪绿病毒的棕果番茄品种提供了辅助手段。
关键词：棕果番茄；gf位点；基因标记
在许多植物的果实成熟和叶片衰老过程中，叶绿素不降解或降解不完全导致其出现滞绿现象，发生的个体为滞绿突变体。到目前为止，在拟南芥、玉米、烟草、高粱等诸多植物中都发现了滞绿突变体。Thomas和Howarth根据衰老时叶绿素含量和光合能力将滞绿突变体分为了5类。目前，人们对番茄的需求不止于风味，更重视它所起到的保健功能，紫果或棕果番茄具有独特的外观，富含强抗氧化能力的花青苷，营养价值较高，受到人们的极大关注婀。但是研究发现，并不是所有的紫果或棕果番茄均富含花青苷，有些紫果或棕果番茄属于C型非功能型绿果肉突变体，这种类型的番茄在果实转红期间叶绿素并不完全消失，而且番茄红素逐渐积累，也会使果实呈现棕色至紫黑色等不同程度颜色的变化。虽然同自然生长的紫果或棕果番茄相比，番茄绿果肉突变体中花青苷含量低，但它的出现为番茄植株叶片衰老的机制研究、果实成熟以及基因功能研究提供了新的思路。同时，番茄绿果肉突变体在粉虱入侵后对病毒的抗病性方面也表现较好，对生产的意义巨大。
近年来，越来越多的人开始利用分子生物学的方法对滞绿突变体进行研究。番茄gf位点突变体，也就是番茄绿果肉突变体，最早在1955年被发现，经研究发现该突变体是由第八染色体上的单个隐性基因SGR（即GF基因）控制的，该基因位于CT265和CT148之间0.44 cM区域。为了确定该基因的变化，HU等克隆了番茄gf位点突变体和野生番茄中的LeSGR1基因，进行DNA序列比对，比对结果发现，在番茄gf位点突变体中发生了单核苷酸替换，导致氨基酸发生了变化。Barry等发现gf位点有gf、gf2、gf3、gf4、gf5共5种等位基因，并且开发了检测gf、gf2、gf5突变体的标记。肖良军等用RT-PCR法扩增到gf突变体中的cDNA序列，将其与红色番茄GF基因的cDNA序列进行比对，设计出检测gf3、gf4突变体的dCAPS标记。笔者综合了上述分子标记的方法对6种棕果番茄材料进行检测，以确定试验材料是否为gf位点突变体及所属突变体类型，为后续番茄材料的抗病育种以及相应SGR基因研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料7份番茄材料由青岛农业大学程斐老师提供，从300份候选材料中筛选而来，其中‘T2015-65’‘T2015-66’‘2012-2’‘2012-3’‘T2016-33’‘T2016-32’为棕果番茄，编号1～6，以‘T2015-47’红果番茄为对照。所有番茄均于2015年5月中旬播种于72孔穴盘中，待幼苗长至3叶1心时移栽至即墨试验基地，常规管理。
1.1.2试剂及引物设计 特异性引物参考Barry等和肖良军等的设计，由青岛擎科梓熙生物有限公司合成。各引物序列及扩增产物长度见表1。酶切所需限制性内切酶Hpy188I酶由NEB公司提供，限制性内切酶MseI酶、DdeI酶由Takara生物科技有限公司提供。其他用于PCR反应和凝胶电泳的试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2试验方法
1.2.1 DNA的提取 取番茄新鲜幼嫩叶片，采用北京天根生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取番茄基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，-20℃冰箱中保存备用。
1.2.2 PCR扩增和酶切PCR反应总体系为20μL：模板DNA 20 ng，2.5 mmol·L-1dNTP 0.4μL，上下游引物（10 mol·L-1）各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Buffer 2.0μL，20 mmol·LMg2 2.0μL，ddH2O补齐至20μL。
用表1中引物对gfallele-f/gfallele-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增后，产物经限制性内切酶Hpy188I于37℃下酶切1 h，可检测是否为gf突变体；利用引物对gf2caps-f/gf2caps-r进行PCR扩增后，产物经限制性内切酶MseI于60℃下酶切1 h，可检测是否为gf2突变体；用引物对dCAPS-F/dCAPS-R进行PCR扩增，产物经限制性内切酶DdeI于37℃下酶切1 h，可检测是否为gf3或gf4突变体；用引物对U316068F/U316068R进行PCR扩增可检测是否为gf5突变体。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火（gfallele-f/gfallele-r 60℃、gf2caps-f/gf2 caps-r 58℃、dCAPS-F/dCAPS-R 50℃、U316068F/U316068R54℃）1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。各PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切片段用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 2结果与分析
2.1番茄基因组DNA电泳检测
在紫外分光光度计下检测基因组DNA的OD2MOD=o值，比值均在1.9左右，纯度较高，可以用于后续试验。同时，用琼脂糖电泳检测的DNA条带清晰，无降解弥散现象（图1），质量较好。
2.2棕果番茄材料gf基因的分子标记检测
用特异性引物gfallele-f/gfallele-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出166 bp的条带（图2）。PCR产物经限制性内切酶Hpy188I酶切后，在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳下检测，gf突变体番茄的PCR产物不能被酶切，其他的均能被酶切为109 bp和57 bp的条带。结果显示，1～4、6号番茄材料同对照一样，都能被酶切为2条带，只有5号不能被酶切，即番茄材料‘T2016-33’为gf基因突变体。
2.3棕果番茄材料gf2基因的分子标记检测
用特异性引物gf2caps-f/gf2caps-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出358 bp的条带（图3）。经限制性内切酶MseI酶切后，gf2。突变体番茄的PCR产物被酶切为187 bp和171 bp的片段，其他的不能被酶切。结果显示，1、2、4～6号条带与对照相同，没有被酶切，3号被酶切为2条带，即番茄材料‘2012-2’为gf2基因突变体。
2.4棕果番茄材料gf3和gf4基因的分子标记检测
用特异性引物dCAPS-F/dCAPS-R对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出231 bp的条带（图4）。PCR产物在限制性内切酶DdeI酶切后，若为gf4突变体，PCR产物则被酶切为216 bp和18 bp的片段，若为gf3突变体，被酶切为小于200 bp的片段，其他的不能被酶切。结果显示，2、6号被酶切为216 bp和18 bp片段（18 bp片段较小，图中未显示），而未有小于200 bp的条带，其他材料与对照相同均未被酶切，所以‘T2015-66’和‘T2016-32’为fg4突变体。
2.5棕果番茄材料gf5基因的分子标记检测
用特异性引物对U316068F/U316068F在红果番茄中可扩增到2 550 bp左右的片段。经测序比对发现，gf5突变体在核苷酸的1 262～2 425 bp之间有1 163 bp的缺失，若为gf5基因突变体，则PCR扩增后只有1 400 bp左右的片段。结果显示，6份番茄材料扩增结果与对照相同，均能扩增到2 550 bp的片段，未有1 400 bp的条带，说明无gf5突变体。
综合以上结果，对7个试验材料的基因型和等位基因进行了统计，结果如表2所示。
3讨论
番茄果实成熟时色泽由绿转红是由色素种类和含量变化所致，主要是由于叶绿素含量下降和类胡萝卜素含量升高。番茄中有很多自然突变体，在果实成熟时，诸多的番茄绿果肉突变体中，无论是gf突变体中单核苷酸的替换，gf2突变体中单核苷酸的插入，gf3和gf5突变体中核苷酸的缺失，还是gf4提前形成终止密码子，都会保留相当数量的叶绿素，使其呈现铁锈色至紫黑色不同程度的颜色。Barry等在26份棕果、紫果或黑果番茄材料中检测到了数量不等的5种gf位点突变体，肖良军等从8份棕果材料中检测到了1個gf、3个gf2、4个gf4突变体，但未发现gf3和gf5突变体。本试验利用Barry等和肖良军等设计的分子标记对6份棕果番茄材料分别进行了分子检测，结果显示在4份棕果番茄中检测到了1个gf、1个gf2、2个gf4突变体，但未检测到gf3和gf5突变体，是由于试验材料较少，今后应该进一步收集资源。在其他2份棕果番茄中未检测出突变体，说明‘T2015-65’和‘2012-3’为富含花青苷的正常棕果番茄。
笔者调查发现，番茄绿果肉突变体在番茄褪绿病毒侵染后，与其他番茄植株相比，黄化叶片极少，整株黄化程度较低，针对番茄褪绿病毒表现出良好抗性。但国内外对gf位点突变体抗或耐番茄褪绿病毒机制的研究不多。本试验结果为番茄抗褪绿病毒病品种选育中有效跟踪和利用gf位点突变体奠定了基础，今后将从生理生化和遗传方面对gf位点基因突变体与抗番茄褪绿病毒的关系进一步深入研究，为育种工作提供理论依据。
关键词：棕果番茄；gf位点；基因标记
在许多植物的果实成熟和叶片衰老过程中，叶绿素不降解或降解不完全导致其出现滞绿现象，发生的个体为滞绿突变体。到目前为止，在拟南芥、玉米、烟草、高粱等诸多植物中都发现了滞绿突变体。Thomas和Howarth根据衰老时叶绿素含量和光合能力将滞绿突变体分为了5类。目前，人们对番茄的需求不止于风味，更重视它所起到的保健功能，紫果或棕果番茄具有独特的外观，富含强抗氧化能力的花青苷，营养价值较高，受到人们的极大关注婀。但是研究发现，并不是所有的紫果或棕果番茄均富含花青苷，有些紫果或棕果番茄属于C型非功能型绿果肉突变体，这种类型的番茄在果实转红期间叶绿素并不完全消失，而且番茄红素逐渐积累，也会使果实呈现棕色至紫黑色等不同程度颜色的变化。虽然同自然生长的紫果或棕果番茄相比，番茄绿果肉突变体中花青苷含量低，但它的出现为番茄植株叶片衰老的机制研究、果实成熟以及基因功能研究提供了新的思路。同时，番茄绿果肉突变体在粉虱入侵后对病毒的抗病性方面也表现较好，对生产的意义巨大。
近年来，越来越多的人开始利用分子生物学的方法对滞绿突变体进行研究。番茄gf位点突变体，也就是番茄绿果肉突变体，最早在1955年被发现，经研究发现该突变体是由第八染色体上的单个隐性基因SGR（即GF基因）控制的，该基因位于CT265和CT148之间0.44 cM区域。为了确定该基因的变化，HU等克隆了番茄gf位点突变体和野生番茄中的LeSGR1基因，进行DNA序列比对，比对结果发现，在番茄gf位点突变体中发生了单核苷酸替换，导致氨基酸发生了变化。Barry等发现gf位点有gf、gf2、gf3、gf4、gf5共5种等位基因，并且开发了检测gf、gf2、gf5突变体的标记。肖良军等用RT-PCR法扩增到gf突变体中的cDNA序列，将其与红色番茄GF基因的cDNA序列进行比对，设计出检测gf3、gf4突变体的dCAPS标记。笔者综合了上述分子标记的方法对6种棕果番茄材料进行检测，以确定试验材料是否为gf位点突变体及所属突变体类型，为后续番茄材料的抗病育种以及相应SGR基因研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1材料7份番茄材料由青岛农业大学程斐老师提供，从300份候选材料中筛选而来，其中‘T2015-65’‘T2015-66’‘2012-2’‘2012-3’‘T2016-33’‘T2016-32’为棕果番茄，编号1～6，以‘T2015-47’红果番茄为对照。所有番茄均于2015年5月中旬播种于72孔穴盘中，待幼苗长至3叶1心时移栽至即墨试验基地，常规管理。
1.1.2试剂及引物设计 特异性引物参考Barry等和肖良军等的设计，由青岛擎科梓熙生物有限公司合成。各引物序列及扩增产物长度见表1。酶切所需限制性内切酶Hpy188I酶由NEB公司提供，限制性内切酶MseI酶、DdeI酶由Takara生物科技有限公司提供。其他用于PCR反应和凝胶电泳的试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2试验方法
1.2.1 DNA的提取 取番茄新鲜幼嫩叶片，采用北京天根生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取番茄基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量，-20℃冰箱中保存备用。
1.2.2 PCR扩增和酶切PCR反应总体系为20μL：模板DNA 20 ng，2.5 mmol·L-1dNTP 0.4μL，上下游引物（10 mol·L-1）各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Buffer 2.0μL，20 mmol·LMg2 2.0μL，ddH2O补齐至20μL。
用表1中引物对gfallele-f/gfallele-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增后，产物经限制性内切酶Hpy188I于37℃下酶切1 h，可检测是否为gf突变体；利用引物对gf2caps-f/gf2caps-r进行PCR扩增后，产物经限制性内切酶MseI于60℃下酶切1 h，可检测是否为gf2突变体；用引物对dCAPS-F/dCAPS-R进行PCR扩增，产物经限制性内切酶DdeI于37℃下酶切1 h，可检测是否为gf3或gf4突变体；用引物对U316068F/U316068R进行PCR扩增可检测是否为gf5突变体。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火（gfallele-f/gfallele-r 60℃、gf2caps-f/gf2 caps-r 58℃、dCAPS-F/dCAPS-R 50℃、U316068F/U316068R54℃）1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。各PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切片段用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。 2结果与分析
2.1番茄基因组DNA电泳检测
在紫外分光光度计下检测基因组DNA的OD2MOD=o值，比值均在1.9左右，纯度较高，可以用于后续试验。同时，用琼脂糖电泳检测的DNA条带清晰，无降解弥散现象（图1），质量较好。
2.2棕果番茄材料gf基因的分子标记检测
用特异性引物gfallele-f/gfallele-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出166 bp的条带（图2）。PCR产物经限制性内切酶Hpy188I酶切后，在8%聚丙烯酰胺凝胶电泳下检测，gf突变体番茄的PCR产物不能被酶切，其他的均能被酶切为109 bp和57 bp的条带。结果显示，1～4、6号番茄材料同对照一样，都能被酶切为2条带，只有5号不能被酶切，即番茄材料‘T2016-33’为gf基因突变体。
2.3棕果番茄材料gf2基因的分子标记检测
用特异性引物gf2caps-f/gf2caps-r对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出358 bp的条带（图3）。经限制性内切酶MseI酶切后，gf2。突变体番茄的PCR产物被酶切为187 bp和171 bp的片段，其他的不能被酶切。结果显示，1、2、4～6号条带与对照相同，没有被酶切，3号被酶切为2条带，即番茄材料‘2012-2’为gf2基因突变体。
2.4棕果番茄材料gf3和gf4基因的分子标记检测
用特异性引物dCAPS-F/dCAPS-R对番茄基因组DNA进行PCR扩增，所有材料均能扩增出231 bp的条带（图4）。PCR产物在限制性内切酶DdeI酶切后，若为gf4突变体，PCR产物则被酶切为216 bp和18 bp的片段，若为gf3突变体，被酶切为小于200 bp的片段，其他的不能被酶切。结果显示，2、6号被酶切为216 bp和18 bp片段（18 bp片段较小，图中未显示），而未有小于200 bp的条带，其他材料与对照相同均未被酶切，所以‘T2015-66’和‘T2016-32’为fg4突变体。
2.5棕果番茄材料gf5基因的分子标记检测
用特异性引物对U316068F/U316068F在红果番茄中可扩增到2 550 bp左右的片段。经测序比对发现，gf5突变体在核苷酸的1 262～2 425 bp之间有1 163 bp的缺失，若为gf5基因突变体，则PCR扩增后只有1 400 bp左右的片段。结果显示，6份番茄材料扩增结果与对照相同，均能扩增到2 550 bp的片段，未有1 400 bp的条带，说明无gf5突变体。
综合以上结果，对7个试验材料的基因型和等位基因进行了统计，结果如表2所示。
3讨论
番茄果实成熟时色泽由绿转红是由色素种类和含量变化所致，主要是由于叶绿素含量下降和类胡萝卜素含量升高。番茄中有很多自然突变体，在果实成熟时，诸多的番茄绿果肉突变体中，无论是gf突变体中单核苷酸的替换，gf2突变体中单核苷酸的插入，gf3和gf5突变体中核苷酸的缺失，还是gf4提前形成终止密码子，都会保留相当数量的叶绿素，使其呈现铁锈色至紫黑色不同程度的颜色。Barry等在26份棕果、紫果或黑果番茄材料中检测到了数量不等的5种gf位点突变体，肖良军等从8份棕果材料中检测到了1個gf、3个gf2、4个gf4突变体，但未发现gf3和gf5突变体。本试验利用Barry等和肖良军等设计的分子标记对6份棕果番茄材料分别进行了分子检测，结果显示在4份棕果番茄中检测到了1个gf、1个gf2、2个gf4突变体，但未检测到gf3和gf5突变体，是由于试验材料较少，今后应该进一步收集资源。在其他2份棕果番茄中未检测出突变体，说明‘T2015-65’和‘2012-3’为富含花青苷的正常棕果番茄。
笔者调查发现，番茄绿果肉突变体在番茄褪绿病毒侵染后，与其他番茄植株相比，黄化叶片极少，整株黄化程度较低，针对番茄褪绿病毒表现出良好抗性。但国内外对gf位点突变体抗或耐番茄褪绿病毒机制的研究不多。本试验结果为番茄抗褪绿病毒病品种选育中有效跟踪和利用gf位点突变体奠定了基础，今后将从生理生化和遗传方面对gf位点基因突变体与抗番茄褪绿病毒的关系进一步深入研究，为育种工作提供理论依据。