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摘要:采用超声波辅助乙醇浸提法对核桃楸外果皮的总蒽醌进行提取。在单因素试验的基础上,通过响应面法,采用Design-Expert 8.0.6软件对各因素进行回归拟合,确定最佳提取条件,并对核桃楸外果皮提取物进行抗氧化性研究。响应面法得到最佳提取条件为:乙醇体积分数75%、超声温度45 ℃、液料比15∶1、超声时间45 min;在最优提取条件下测得核桃楸外果皮总蒽醌的提取率为3.25 mg/g。抗氧化性研究结果表明,外果皮中总蒽醌提取物对羟基自由基、亚硝酸根离子和超氧阴离子均表现出显著的清除效果;对3种自由基的清除能力强弱顺序为:羟基自由基>超氧阴离子>亚硝酸根离子,总蒽醌提取物对3种自由基的清除能力整体强于对照品抗坏血酸,表明核桃楸外果皮总蒽醌提取物具有较强的抗氧化性,是一种良好的天然抗氧化剂。
关键词:核桃楸外果皮;响应面法;总蒽醌;抗氧化
中图分类号:S792;R285文献标识码:A文章编号:1006-8023(2019)03-0048-06
Extraction of Total Anthraquinones from Green Peel of
Juglans mandshurica Maxim and Its Antioxidant Activity
WU Mian, SUN Molong*
(College of Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
Abstract:Total anthraquinones were extracted from green peel of Juglans mandshurica Maxim by ultrasonic with ethanol extraction. On the basis of single factor test and response surface method, regression fitting of each factor was carried out by using Design-Expert 8.0.6 software. The optimum extraction conditions were determined by the response surface method, and the antioxidant activity of the extracts was also studied. The extraction condition was determined: 75% volume fraction of ethanol, the temperature was 45 ℃, the ratio of liquid to material was 15∶1, ultrasonic time was 45 min. Total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica was 3.25 mg g-1. The results of antioxidation study showed that total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica had obvious scavenging effect on hydroxyl radical, nitrite ion and superoxide anion. The order of its ability to scavenge the three kinds of free radical was hydroxyl radical > superoxide anion > nitrite ion. The scavenging ability of anthraquinone on these three free radicals was stronger than that of ascorbic acid. This showed that the anthraquinone had strong antioxidant activity and was a good natural antioxidant.
Keywords:Green peel of Juglans mandshurica Maxim; response surface methodology; total anthraquinone; antioxidant
0引言
核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)又名山核桃或胡桃楸,為胡桃科胡桃属落叶乔木,主要分布于我国东北、华北等地区,是东北阔叶红松林的重要伴生树种,也是重要的药源植物[1]。核桃楸外果皮中含有单宁、胡桃醌、α-和β-氢化胡桃叶醌等,主要成分还有黄酮类、多酚类和萘醌类物质[2-5],具有杀虫、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等性质[6-10]。蒽醌类化合物在植物中可游离存在,也可与糖结合成蒽苷。游离蒽醌与结合蒽醌因都含有酚羟基,能与不同的碱形成类盐物,具有消炎、抗癌及抗病毒等作用[11-13]。目前对核桃楸的研究主要关于外果皮中主要的化学成分、胡桃醌及总黄酮含量、乙醇提取物的抑菌和杀虫活性等方面,但对核桃楸中蒽醌类物质的提取及其活性的研究甚少。目前,蒽醌类物质主要提取方法有水提法,酸性、碱性有机溶剂提取等[14-15]。因此,对核桃楸中蒽醌类物质进行提取,充分开发核桃楸外果皮的活性成分,对核桃楸资源进行合理利用是十分必要的。笔者采用超声波辅助法对核桃楸外果皮中的总蒽醌进行提取,确定了最佳提取条件,并且对其进行了抗氧化性研究。 1材料与方法
1.1试验材料
材料:核桃楸外果皮2017年采于东北林业大学实验林场。试剂:1,8-二羟基蒽醌标准品,中国药品生物制品检定所;醋酸镁等其他试剂均为分析纯。仪器:RE-2000A旋转蒸发仪,KQ3200DE型数控超声波清洗器;800型电动离心机;TU-1901型紫外分光光度计。
1.2试验方法
1.2.1核桃楸外果皮总蒽醌的提取优化试验
(1)1,8-二羟基蒽醌标准曲线的绘制
总蒽醌含量测定采用醋酸镁显色法[16]。精準配制1,8-二羟基蒽醌标准溶液0.100 mg/mL,精密移取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色,定容至10 mL容量瓶中,在512 nm波长条件下,采用紫外分光光度法测定吸光度A,得到标准曲线线性回归方程A=62.441c+0.02(c为标准品溶液的浓度,mg/mL),R2=0.999 4。
(2)单因素试验及响应面优化试验
在乙醇体积分数、超声时间、超声温度和液料比中,先选1个因素作为唯一变量,其他因素不变的条件下,探究4个液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1,4个乙醇体积分数60%、70%、80%、90%,4个超声时间30、40、50、60 min,4个超声温度30、40、50、60 ℃对总蒽醌提取率的影响。根据单因素试验,核桃楸外果皮中总蒽醌提取的最优提取条件为:乙醇体积分数75%,液料比15∶1,超声时间45 min,超声温度45℃。超声温度相较于其他3个因素,对总蒽醌的提取率影响较低。
在单因素试验的基础上根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[17-19],运用Design-Expert软件,选择对核桃楸外果皮中总蒽醌提取工艺影响显著的3个因素即超声时间、乙醇体积分数和液料比作为设计对象,同时在控制单一变量的条件下为每个因素设计3个水平。以总蒽醌提取得率为响应值Y,对影响超声提取核桃楸外果皮总蒽醌的工艺参数进行优化,最后得到最佳提取条件。表1为各试验设计因素与水平。
(3)总蒽醌提取及含量测定
总蒽醌提取采用乙醇浸提法[16]。称取核桃楸外果皮粗粉10 g,加入150 mL的75%乙醇溶液,在超声波清洗器中以45 ℃超声震荡45 min,抽滤保留滤液,减压蒸馏回收乙醇溶液,得到乙醇提取物浓缩液。往乙醇提取物浓缩液中加入10 mL的20%H2SO4和5 mL的10%FeCl3溶液,在80℃水中水解1 h。静置冷却后多次加入氯仿萃取,合并氯仿液,减压蒸馏,得到总蒽醌提取物浸膏。将浸膏溶于无水甲醇中,定容于50 mL容量瓶中。精密移取4 mL总蒽醌提取物甲醇溶液,减压蒸馏除去甲醇后,加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色,摇匀溶解,定容至50 mL容量瓶中。静置30 min后在512 nm波长处测其吸光度,将A值带入线性回归方程,得到核桃楸外果皮中的总蒽醌含量。
1.2.2核桃楸外果皮总蒽醌的抗氧化性试验
本研究分别采用水杨酸法、重氮偶合比色法和邻苯三酚法来测定总蒽醌提取物对羟基自由基(·OH)、亚硝酸根离子(NO3-)和超氧阴离子(O2-)的清除率[10]。选用6~24 μg/mL的5个浓度梯度的总蒽醌提取物溶液,配制同样5个浓度梯度的苯甲酸溶液和抗坏血酸溶液作为对照品,以蒸馏水为空白对照,分别测定3个自由基在510、538、320 nm处的吸光度An以及空白样的吸光度A0。以清除率E来衡量核桃楸外果皮中总蒽醌提取物的抗氧化性。清除率的计算公式为[19]:
E=A0-AnA0×100%。 (1)
2结果与分析
2.1核桃楸外果皮总蒽醌的提取结果分析
2.1.1核桃楸外果皮总蒽醌提取条件优化
以总蒽醌提取率为响应值Y,对影响超声提取核桃楸外果皮总蒽醌的工艺参数(A为乙醇体积分数,B为超声时间,C为液料比)进行优化,最后得到最佳提取条件,试验结果见表2。
采用Design-Expert 8.0.6软件对各因素进行回归拟合,得到回归方程:
Y=-3.12+0.05A+0.02B+0.11C+5.54AB+0.77AC+1.06BC-3.14A2-2.9B2-3.28C2。
根据回归方程方差分析,决定系数R2=0.993 3,变异系数CV=4.93%,说明该回归模型的拟合方程与实际情况相符合,且误差较小,可以反映出各因素与响应值之间的关系。响应面方差分析表明,该模型的P<0.000 1说明该二次方程模型F为极显著,试验具有很高的可信性和准确性。根据显著性分析结果显示,各种因素之间存在一定的交互作用,模型中一次项C,二次项A2、B2、C2均为差异性极显著影响因素(P<0.000 1),一次项B,交互项AB为差异性显著影响因素(P<0.05)。A、B、C这3个因素对提取率的回归系数检验值F分别为0.30、16.01、123.52,由此推断出,各因素对总蒽醌提取率的影响大小顺序为:液料比(C)>超声时间(B)>乙醇体积分数(A)。
2.1.2响应面图的分析
根据回归模型绘制出的总蒽醌提取率响应面的三维图(图1),可直观显示出响应面的最高点以及因素间的交互作用对响应值的影响,即总蒽醌的最佳提取条件。
由图1可以看出,液料比和乙醇体积分数、液料比和超声时间、乙醇体积分数和超声时间对总蒽醌提取率的影响皆为显著的二次抛物线,任意两个因素之间也有显著的交互作用。响应面曲面的坡度代表着该因素对总蒽醌提取率影响的强弱程度,响应面等高线越圆,说明两个因素间的交互作用越小[20];响应面等高线越接近椭圆,说明两个因素间的交互作用越大[19]。 由圖1(a)可以看出,乙醇体积分数A和超声时间B的交互作用对总蒽醌提取率影响较大,乙醇体积分数在75%左右和超声时间在45 min时左右,出现极值。由图1(b)可看出,乙醇体积分数A与液料比C的交互作用对总蒽醌提取率影响较大,乙醇体积分数在75%左右和液料比在15∶1左右时,出现极值。由图1(c)可看出,响应面图较圆,超声时间B和液料比C的交互作用对总蒽醌提取率影响较小,超声时间在45 min左右和液料比在15∶1左右时,出现极值。根据响应面的设计分析,核桃楸外果皮中总蒽醌的较优提取条件为:乙醇体积分数75%,超声时间45 min,液料比15∶1;在最优提取条件下测得核桃楸外果皮总蒽醌的提取率为3.25 mg/g。
2.2核桃楸外果皮总蒽醌提取物抗氧化性结果分析
通过测定核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH、NO3-、O2-的清除能力,确定核桃楸外果皮总蒽醌提取物的抗氧化性,为保证实验更具准确性,每组实验进行三组平行实验,结果取其平均值,总蒽醌提取物对3种自由基的清除作用通过清除率衡量,见表3。
由表3可知,核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH羟基自由基、NO3-、O2-的清除率均随着总蒽醌提取物浓度增大而增大,具有清除作用即抗氧化性。通过与苯甲酸和抗坏血酸进行对照试验可以看出,在相同浓度下总蒽醌提取物的抗氧化性强于苯甲酸和抗坏血酸,其相对顺序为外果皮总蒽醌提取物>抗坏血酸>苯甲酸。
由清除率与总蒽醌提取物溶液浓度之间的关系,得到3个线性回归方程为:
y=2.54x+10.95(R2=0.976 4)。
y=1.33x+17.95(R2=0.973 3)。
y=1.73x+10.89(R2=0.980 3)。
半抑制浓度IC50是抗氧化剂的抗氧化清除作用达到50%时的浓度,它的大小与抗氧化剂和提供活性氧的物质的性能有关,在抗氧化试验中用来表征抗氧化作用的强弱[21]。相同条件下IC50值越小,清除能力即抗氧化性能力越强。由回归方程可得核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH的抗氧化IC50值为15.37 μg/mL;对NO3-的抗氧化IC50值为24.10 μg/mL;对O2-的抗氧化IC50值为22.61 μg/mL。
总蒽醌提取物对3种自由基均具有显著的清除能力,核桃楸外果皮总蒽醌提取物的IC50(NO3-)>IC50(O2-)>IC50(·OH),相同条件下IC50值越小,说明较低浓度便可以达到50%的清除效果,即抗氧化性能更强,故核桃楸外果皮总蒽醌提取物对这3种自由基的抗氧化性顺序是:·OH>O2->NO3-。
3结论
蒽醌类物质是各种天然醌类化合物中数量最多的一种,本研究通过1,8-二羟基蒽醌标准品鉴定证实核桃楸外果皮中含有蒽醌类物质,并通过响应面法优化其提取条件,同时对核桃楸总蒽醌进行了抗氧化活性研究。
蒽醌类物质广泛存在于大黄、芦荟和决明子等植物当中。李培[22]等在单因素的试验基础上,设计正交试验优化芦荟中蒽醌类化合物的超声波提取工艺,得到蒽醌提取率为6.41 mg/g。本研究采用乙醇浸提法提取核桃楸外果皮中的总蒽醌,在单因素试验的基础上,通过响应面法,采用Design-Expert 8.0.6软件对各因素进行回归拟合。由数据推断出各因素对总蒽醌提取率的影响大小顺序为:液料比>超声时间>乙醇体积分数,并确定最优提取条件为:乙醇浓度75%、液料比15∶1、超声温度45℃、超声时间45 min。采用紫外-可见分光光度法测定外果皮提取液中总蒽醌的含量,在最优提取条件下测得核桃楸外果皮总蒽醌的提取率为3.25 mg/g。
蒽醌类物质能够阻断自由基链式反应,具有抗氧化作用。李敏[23]等采用超临界CO2萃取技术从何首乌中提取出蒽醌类物质,将提取物应用于清除·OH的抗氧化活性研究,结果表明何首乌中的蒽醌对·OH有很好的清除效果。本实验对总蒽醌提取物进行的抗氧化试验研究结果表明,总蒽醌提取物对·OH、NO3-、O2-均有明显的清除效果,IC50(NO3-)为24.10 μg/mL,IC50(O2-)为22.61 μg/mL,IC50(·OH)为15.37 μg/mL,其对3种自由基的清除能力强弱顺序为:·OH>O2->NO3-。总蒽醌提取物对3种自由基的清除能力整体强于抗坏血酸和苯甲酸,在浓度比较低的情况下依然有抗氧化作用,表明核桃楸外果皮总蒽醌提取物具有较强的抗氧化性,是一种良好的天然抗氧化剂,具有很好的开发和利用价值。
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关键词:核桃楸外果皮;响应面法;总蒽醌;抗氧化
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Extraction of Total Anthraquinones from Green Peel of
Juglans mandshurica Maxim and Its Antioxidant Activity
WU Mian, SUN Molong*
(College of Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040)
Abstract:Total anthraquinones were extracted from green peel of Juglans mandshurica Maxim by ultrasonic with ethanol extraction. On the basis of single factor test and response surface method, regression fitting of each factor was carried out by using Design-Expert 8.0.6 software. The optimum extraction conditions were determined by the response surface method, and the antioxidant activity of the extracts was also studied. The extraction condition was determined: 75% volume fraction of ethanol, the temperature was 45 ℃, the ratio of liquid to material was 15∶1, ultrasonic time was 45 min. Total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica was 3.25 mg g-1. The results of antioxidation study showed that total anthraquinone from green peel of Juglans mandshurica had obvious scavenging effect on hydroxyl radical, nitrite ion and superoxide anion. The order of its ability to scavenge the three kinds of free radical was hydroxyl radical > superoxide anion > nitrite ion. The scavenging ability of anthraquinone on these three free radicals was stronger than that of ascorbic acid. This showed that the anthraquinone had strong antioxidant activity and was a good natural antioxidant.
Keywords:Green peel of Juglans mandshurica Maxim; response surface methodology; total anthraquinone; antioxidant
0引言
核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)又名山核桃或胡桃楸,為胡桃科胡桃属落叶乔木,主要分布于我国东北、华北等地区,是东北阔叶红松林的重要伴生树种,也是重要的药源植物[1]。核桃楸外果皮中含有单宁、胡桃醌、α-和β-氢化胡桃叶醌等,主要成分还有黄酮类、多酚类和萘醌类物质[2-5],具有杀虫、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等性质[6-10]。蒽醌类化合物在植物中可游离存在,也可与糖结合成蒽苷。游离蒽醌与结合蒽醌因都含有酚羟基,能与不同的碱形成类盐物,具有消炎、抗癌及抗病毒等作用[11-13]。目前对核桃楸的研究主要关于外果皮中主要的化学成分、胡桃醌及总黄酮含量、乙醇提取物的抑菌和杀虫活性等方面,但对核桃楸中蒽醌类物质的提取及其活性的研究甚少。目前,蒽醌类物质主要提取方法有水提法,酸性、碱性有机溶剂提取等[14-15]。因此,对核桃楸中蒽醌类物质进行提取,充分开发核桃楸外果皮的活性成分,对核桃楸资源进行合理利用是十分必要的。笔者采用超声波辅助法对核桃楸外果皮中的总蒽醌进行提取,确定了最佳提取条件,并且对其进行了抗氧化性研究。 1材料与方法
1.1试验材料
材料:核桃楸外果皮2017年采于东北林业大学实验林场。试剂:1,8-二羟基蒽醌标准品,中国药品生物制品检定所;醋酸镁等其他试剂均为分析纯。仪器:RE-2000A旋转蒸发仪,KQ3200DE型数控超声波清洗器;800型电动离心机;TU-1901型紫外分光光度计。
1.2试验方法
1.2.1核桃楸外果皮总蒽醌的提取优化试验
(1)1,8-二羟基蒽醌标准曲线的绘制
总蒽醌含量测定采用醋酸镁显色法[16]。精準配制1,8-二羟基蒽醌标准溶液0.100 mg/mL,精密移取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色,定容至10 mL容量瓶中,在512 nm波长条件下,采用紫外分光光度法测定吸光度A,得到标准曲线线性回归方程A=62.441c+0.02(c为标准品溶液的浓度,mg/mL),R2=0.999 4。
(2)单因素试验及响应面优化试验
在乙醇体积分数、超声时间、超声温度和液料比中,先选1个因素作为唯一变量,其他因素不变的条件下,探究4个液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1,4个乙醇体积分数60%、70%、80%、90%,4个超声时间30、40、50、60 min,4个超声温度30、40、50、60 ℃对总蒽醌提取率的影响。根据单因素试验,核桃楸外果皮中总蒽醌提取的最优提取条件为:乙醇体积分数75%,液料比15∶1,超声时间45 min,超声温度45℃。超声温度相较于其他3个因素,对总蒽醌的提取率影响较低。
在单因素试验的基础上根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[17-19],运用Design-Expert软件,选择对核桃楸外果皮中总蒽醌提取工艺影响显著的3个因素即超声时间、乙醇体积分数和液料比作为设计对象,同时在控制单一变量的条件下为每个因素设计3个水平。以总蒽醌提取得率为响应值Y,对影响超声提取核桃楸外果皮总蒽醌的工艺参数进行优化,最后得到最佳提取条件。表1为各试验设计因素与水平。
(3)总蒽醌提取及含量测定
总蒽醌提取采用乙醇浸提法[16]。称取核桃楸外果皮粗粉10 g,加入150 mL的75%乙醇溶液,在超声波清洗器中以45 ℃超声震荡45 min,抽滤保留滤液,减压蒸馏回收乙醇溶液,得到乙醇提取物浓缩液。往乙醇提取物浓缩液中加入10 mL的20%H2SO4和5 mL的10%FeCl3溶液,在80℃水中水解1 h。静置冷却后多次加入氯仿萃取,合并氯仿液,减压蒸馏,得到总蒽醌提取物浸膏。将浸膏溶于无水甲醇中,定容于50 mL容量瓶中。精密移取4 mL总蒽醌提取物甲醇溶液,减压蒸馏除去甲醇后,加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色,摇匀溶解,定容至50 mL容量瓶中。静置30 min后在512 nm波长处测其吸光度,将A值带入线性回归方程,得到核桃楸外果皮中的总蒽醌含量。
1.2.2核桃楸外果皮总蒽醌的抗氧化性试验
本研究分别采用水杨酸法、重氮偶合比色法和邻苯三酚法来测定总蒽醌提取物对羟基自由基(·OH)、亚硝酸根离子(NO3-)和超氧阴离子(O2-)的清除率[10]。选用6~24 μg/mL的5个浓度梯度的总蒽醌提取物溶液,配制同样5个浓度梯度的苯甲酸溶液和抗坏血酸溶液作为对照品,以蒸馏水为空白对照,分别测定3个自由基在510、538、320 nm处的吸光度An以及空白样的吸光度A0。以清除率E来衡量核桃楸外果皮中总蒽醌提取物的抗氧化性。清除率的计算公式为[19]:
E=A0-AnA0×100%。 (1)
2结果与分析
2.1核桃楸外果皮总蒽醌的提取结果分析
2.1.1核桃楸外果皮总蒽醌提取条件优化
以总蒽醌提取率为响应值Y,对影响超声提取核桃楸外果皮总蒽醌的工艺参数(A为乙醇体积分数,B为超声时间,C为液料比)进行优化,最后得到最佳提取条件,试验结果见表2。
采用Design-Expert 8.0.6软件对各因素进行回归拟合,得到回归方程:
Y=-3.12+0.05A+0.02B+0.11C+5.54AB+0.77AC+1.06BC-3.14A2-2.9B2-3.28C2。
根据回归方程方差分析,决定系数R2=0.993 3,变异系数CV=4.93%,说明该回归模型的拟合方程与实际情况相符合,且误差较小,可以反映出各因素与响应值之间的关系。响应面方差分析表明,该模型的P<0.000 1说明该二次方程模型F为极显著,试验具有很高的可信性和准确性。根据显著性分析结果显示,各种因素之间存在一定的交互作用,模型中一次项C,二次项A2、B2、C2均为差异性极显著影响因素(P<0.000 1),一次项B,交互项AB为差异性显著影响因素(P<0.05)。A、B、C这3个因素对提取率的回归系数检验值F分别为0.30、16.01、123.52,由此推断出,各因素对总蒽醌提取率的影响大小顺序为:液料比(C)>超声时间(B)>乙醇体积分数(A)。
2.1.2响应面图的分析
根据回归模型绘制出的总蒽醌提取率响应面的三维图(图1),可直观显示出响应面的最高点以及因素间的交互作用对响应值的影响,即总蒽醌的最佳提取条件。
由图1可以看出,液料比和乙醇体积分数、液料比和超声时间、乙醇体积分数和超声时间对总蒽醌提取率的影响皆为显著的二次抛物线,任意两个因素之间也有显著的交互作用。响应面曲面的坡度代表着该因素对总蒽醌提取率影响的强弱程度,响应面等高线越圆,说明两个因素间的交互作用越小[20];响应面等高线越接近椭圆,说明两个因素间的交互作用越大[19]。 由圖1(a)可以看出,乙醇体积分数A和超声时间B的交互作用对总蒽醌提取率影响较大,乙醇体积分数在75%左右和超声时间在45 min时左右,出现极值。由图1(b)可看出,乙醇体积分数A与液料比C的交互作用对总蒽醌提取率影响较大,乙醇体积分数在75%左右和液料比在15∶1左右时,出现极值。由图1(c)可看出,响应面图较圆,超声时间B和液料比C的交互作用对总蒽醌提取率影响较小,超声时间在45 min左右和液料比在15∶1左右时,出现极值。根据响应面的设计分析,核桃楸外果皮中总蒽醌的较优提取条件为:乙醇体积分数75%,超声时间45 min,液料比15∶1;在最优提取条件下测得核桃楸外果皮总蒽醌的提取率为3.25 mg/g。
2.2核桃楸外果皮总蒽醌提取物抗氧化性结果分析
通过测定核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH、NO3-、O2-的清除能力,确定核桃楸外果皮总蒽醌提取物的抗氧化性,为保证实验更具准确性,每组实验进行三组平行实验,结果取其平均值,总蒽醌提取物对3种自由基的清除作用通过清除率衡量,见表3。
由表3可知,核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH羟基自由基、NO3-、O2-的清除率均随着总蒽醌提取物浓度增大而增大,具有清除作用即抗氧化性。通过与苯甲酸和抗坏血酸进行对照试验可以看出,在相同浓度下总蒽醌提取物的抗氧化性强于苯甲酸和抗坏血酸,其相对顺序为外果皮总蒽醌提取物>抗坏血酸>苯甲酸。
由清除率与总蒽醌提取物溶液浓度之间的关系,得到3个线性回归方程为:
y=2.54x+10.95(R2=0.976 4)。
y=1.33x+17.95(R2=0.973 3)。
y=1.73x+10.89(R2=0.980 3)。
半抑制浓度IC50是抗氧化剂的抗氧化清除作用达到50%时的浓度,它的大小与抗氧化剂和提供活性氧的物质的性能有关,在抗氧化试验中用来表征抗氧化作用的强弱[21]。相同条件下IC50值越小,清除能力即抗氧化性能力越强。由回归方程可得核桃楸外果皮总蒽醌提取物对·OH的抗氧化IC50值为15.37 μg/mL;对NO3-的抗氧化IC50值为24.10 μg/mL;对O2-的抗氧化IC50值为22.61 μg/mL。
总蒽醌提取物对3种自由基均具有显著的清除能力,核桃楸外果皮总蒽醌提取物的IC50(NO3-)>IC50(O2-)>IC50(·OH),相同条件下IC50值越小,说明较低浓度便可以达到50%的清除效果,即抗氧化性能更强,故核桃楸外果皮总蒽醌提取物对这3种自由基的抗氧化性顺序是:·OH>O2->NO3-。
3结论
蒽醌类物质是各种天然醌类化合物中数量最多的一种,本研究通过1,8-二羟基蒽醌标准品鉴定证实核桃楸外果皮中含有蒽醌类物质,并通过响应面法优化其提取条件,同时对核桃楸总蒽醌进行了抗氧化活性研究。
蒽醌类物质广泛存在于大黄、芦荟和决明子等植物当中。李培[22]等在单因素的试验基础上,设计正交试验优化芦荟中蒽醌类化合物的超声波提取工艺,得到蒽醌提取率为6.41 mg/g。本研究采用乙醇浸提法提取核桃楸外果皮中的总蒽醌,在单因素试验的基础上,通过响应面法,采用Design-Expert 8.0.6软件对各因素进行回归拟合。由数据推断出各因素对总蒽醌提取率的影响大小顺序为:液料比>超声时间>乙醇体积分数,并确定最优提取条件为:乙醇浓度75%、液料比15∶1、超声温度45℃、超声时间45 min。采用紫外-可见分光光度法测定外果皮提取液中总蒽醌的含量,在最优提取条件下测得核桃楸外果皮总蒽醌的提取率为3.25 mg/g。
蒽醌类物质能够阻断自由基链式反应,具有抗氧化作用。李敏[23]等采用超临界CO2萃取技术从何首乌中提取出蒽醌类物质,将提取物应用于清除·OH的抗氧化活性研究,结果表明何首乌中的蒽醌对·OH有很好的清除效果。本实验对总蒽醌提取物进行的抗氧化试验研究结果表明,总蒽醌提取物对·OH、NO3-、O2-均有明显的清除效果,IC50(NO3-)为24.10 μg/mL,IC50(O2-)为22.61 μg/mL,IC50(·OH)为15.37 μg/mL,其对3种自由基的清除能力强弱顺序为:·OH>O2->NO3-。总蒽醌提取物对3种自由基的清除能力整体强于抗坏血酸和苯甲酸,在浓度比较低的情况下依然有抗氧化作用,表明核桃楸外果皮总蒽醌提取物具有较强的抗氧化性,是一种良好的天然抗氧化剂,具有很好的开发和利用价值。
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