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【摘要】 目的：探讨银屑病（PSG）患者外周血白细胞膜CD14及血浆可溶性CD14表达的临床意义分析。方法：选择36例寻常性PSG患者（PSG组）和52例健康体检者（健康对照组），观察和比较两组外周血白细胞mCD14及sCD14表达水平。结果：PSG组患者外周血白细胞膜联mCDl4的表达水平为（6.20±2.20）%，其中进行期、静止期分别为（7.30±2.40）%、（4.70±2.20）%，均较健康对照组明显增高（P<0.01）。PSG组患者外周血白细胞膜sCD14的浓度平均为（1.39±0.38）μg/mL，其中进行期、静止期分别为（1.42±0.39）μg/mL、（1.21±0.44）μg/mL，均较健康对照组显著增高（P<0.01）。结论：外周血白细胞膜CD14及血浆可溶性CD14对银屑病的发病机制、临床诊断等均有重要的意义。同时有助有于进一步探讨PSG发病机制。
【关键词】 外周血白细胞膜CD14； 血浆可溶性CD14； 银屑病； 表达； 皮损
银屑病（Parapsoriasis guttata，PSG）属于一种多发性慢性炎症性皮肤病，往往病程迁延，反复发作。病理研究发现，PSG是在多基因遗传条件下T细胞功能异常导致的免疫性疾病[1-2]。PSG发病机理与免疫力、细菌或病毒感染、遗传因素、神经递质及精神状态等关系密切。细菌感染是诱发PSG加重的一个重要因素。研究表明，革兰阴性杆菌是导致部分慢性炎症的主要致病菌，此类阴性杆菌长期大量生长及死亡，释放、裂解出细胞壁脂多糖即内毒素，能够扩张血管，增高中性粒细胞及血管通透性，并激活补体[3]。内毒素组成主要是脂多糖，脂多糖与内毒素受体膜联CD14（mCD14）、Toll样受体（TLR4）、MD-2等受体复合物相结合，可激活细胞信号传导通路，进而激活核因子KB（NFKB），生成肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8及干扰素γ等炎症因子[4]。此类炎症因子在PSG发病过程中发挥重要作用[5-6]。因此，脂多糖及其信号通路在PSG发病过程扮演重要角色。本研究测定了PSG患者外周血白细胞mCD14及血浆中可溶性CD14（soluble CD14，sCD14）的表达，以分析内毒素信号转导通路激活与PSG的相互关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2009年5月-2012年5月于本院门诊诊治的寻常性PSG患者36例（PSG组），均符合第3版《临床皮肤病学》相关诊断标准，临床症状典型。男22例，女14例，年龄23～53岁，平均（35.4±7.1）岁，病程7个月～18年，平均（2.7±1.1）年。以严重性指数（PASI）及PSG皮损面积对PSG患者病情状态进行评估[4]。其中，进行期20例（55.6%），静止期16例（44.4%）。入选患者最近1个月内未接受过药物如糖皮质激素、抗生素、免疫抑制剂及光化学药物系统疗法，肝肾功能均正常；选择同期在本院行常规健康体检并检查合格的志愿者（健康对照组）52例，男29例，女23例，年龄21～56岁，平均（36.1±8.4）岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 外周血白细胞表面mCD14表达的检测
1.2.1.1 两组全血标本的采集 两组均采集3 mL静脉血，以乙二胺四乙酸（EDTA）-K2为抗凝剂。
1.2.1.2 直接法免疫荧光标记 按使用说明书及实际样本量配制所需量的试剂。取100 μL EDTA抗凝的人外周静脉血，添加20 μL的荧光抗体抗mCD14-APC，混和均匀，避光孵育30 min。添加2 mL红细胞溶解液并混合均匀，室温条件下孵育10 min，至孵育液完全澄清透明。1000 rpm离心5 min，弃上清，将细胞悬浮在约0.5 mL的4%多聚甲醛溶液中，振荡混匀后以流式细胞仪（美国guava）进行检测。
1.2.1.3 使用同型对照荧光测定阴性范围 完成各通道之间荧光补偿值设置后，依次进行标本检测，作CD14荧光的直方图，应用CellQuest软件对检测结果进行分析。
1.2.2 血浆中sCD14水平的检测
1.2.2.1 血浆标本采集 上述实验过程中剩下的EDTA抗凝血样本，在2000 rpm条件下，离心8 min获得血浆，保存于-80 ℃直至检测。
1.2.2.2 ELISA检测 取出酶标板，每孔中加入100 μL的抗体稀释液。之后添加100 μL的标准品、样品及对照品，混合均匀，每样本作为2个复孔。室温条件下孵育3 h后吸干孔中的液体，加入300 μL洗液洗涤，反复4次。每孔中添加200 μL的sCD14酶结合物，室温条件下孵育l h。反复洗涤3次后，每个孔中添加200 μL的底物，室温条件下孵育30 min。每孔加入50 μL的终止液，30 min内在酶标仪上，于450 nm波长处读取各孔吸光度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流式细胞仪的检测结果 PSG组患者外周血白细胞膜mCD14的表达水平平均为（6.20±2.20）%，其中进行期、静止期分别为（7.30±2.40）%、（4.70±2.20）%，均较健康对照组明显增高 （P<0.01）；且进行期、静止期比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 ELISA法检测结果 PSG组患者外周血白细胞膜sCD14的浓度平均为（1.39±0.38）μg/mL，其中进行期、静止期分别为（1.42±0.39）μg/mL、（1.21±0.44）μg/mL，均较健康对照组显著增高 （P<0.01）。见表1。 表1 银屑病患者组与健康体检对照组外周血白细胞mCD14及sCD14表达水平比较（x±s）
组别 mCD14表达（%） sCD14表达（μg/mL）
PSG组（n=36） 6.20±2.20* 1.39±0.38*
进行期（n=20） 7.30±2.40*△ 1.42±0.39*
静止期（n=16） 4.70±2.20* 1.21±0.44*
健康对照组（n=52） 3.57±0.90 1.07±0.32
*与健康对照组比较，P<0.01；△与静止期比较，P<0.05
3 讨论
之前对细菌感染诱发PSG的研究多集中在革兰阳性杆菌超抗原，如金黄色葡萄球菌肠毒素B、链球菌致热性肠毒素A、中毒性休克蛋白-1等，此类革兰阳性杆菌超抗原能够激活T淋巴细胞，合成不同类型的炎症因子，刺激角质致使细胞增殖，而触发PSG的发生[7]。临床上，笔者经常见到合并革兰阴性杆菌感染诱发的各类慢性炎症PSG患者病情迁延不愈或随炎症程度而加重的现象，肠道和胆道感染、萎缩性胃炎、泌尿生殖炎症等。皮损程度往往随病情的加重而加重，提示此类病灶可能与PSG发病关系密切。内毒素是革兰阴性杆菌的主要致病物质，其成分主要为脂多糖[8]。脂多糖可产生多种强的生理学效应，对宿主先天存在及环境适应性免疫反应均有显著的影响。脂多糖内毒素与细胞膜上的mCD14、Toll样受体4（Toll-likereceptor 4，TLR4）等受体复合物相结合能启动细胞内部的信号转导通路，最终激活NF-KB，通过对基因转录的调节合成大量的细胞因子，包括不同类型的黏附分子、前列腺素、趋化因子及一氧化氮等。不同类型的炎性因子如IL-6、IL-8、ICAM-1、肿瘤坏死因子α、一氧化氮、前列腺素2等均在PSG中高度高表达[9]。有研究报道，PSG患者可能有胆汁酸分泌上的缺陷，可将从肠道吸收内毒素分解代谢为无毒性产物，以去氢胆酸治疗PSG临床疗效较常规疗法更好。总之，怀疑内毒素及其信号传导通路很有可能在PSG发病机制中扮演重要角色[10]。
CD14是脂多糖LPS受体复合物重要成员，TLR4等一同介导LPS跨膜信号转导[11]。CD14属于单核或巨噬细胞表面的一种高度分化的抗原，属于糖蛋白，它有两种存在形式：mCD14及sCD14。mCD14主要存在于细胞膜上，而其表达则主要在单核/巨噬细胞等髓样细胞表面，是单核/巨噬细胞高度分化的典型特征[12-13]。中性粒细胞细胞膜表面也存在少量mCD14。sCD14主要存在于血清中，来源于髓样细胞分泌或mCD14的脱落。人体内CD14分子以sCD14为主要存在形式[14-15]。研究表明，LPS作用后的人外周静脉血单核细胞mCD14的表达水平显著增高；内毒素血症时患者外周血sCD14水平也较健康状态时明显上升，推测CD14的升高提示可能存在感染[16-17]。王琼玉等[18]研究显示，寻常性PSG患者血清及皮损吸疱液中sCD14浓度均较健康人明显上升，经治疗后患者血清sCD14可降至正常。提示PSG患者单核细胞活性异常升高，并进一步推测PSG患者可能出现血清内毒素升高[19-20]。本实验中，PSG组外周血白细胞膜mCD14的表达水平以及进行期、静止期水平均较健康对照组明显增高（P<0.01）；且进行期高于静止期 （P<0.05）。银屑病组患者外周血白细胞膜sCD14的平均浓度及进行期、静止期浓度均较健康对照组显著增高（P<0.01）。本结果与Schopf的相关结论一致，且流式细胞仪测定亦证实PSG患者外周血白细胞表面的mCD14表达量显著上调，表明PSG患者血浆中内毒素浓度很可能是异常增高的[21]。
总之，内毒素及其信号传导通路在PSG发病中起重要作用[22-23]。但对于各种内毒素作用于T淋巴细胞导致角质形成细胞增殖的准确机制，仍需深入的体内、体外相关实验研究[24]。对此领域的进一步研究将有助于进一步探讨PSG发病机制，并为银屑病治疗寻找新的方法[25]。
参考文献
[1] 朱可建，商惠英，劳力民，等.寻常性银屑病患者外周血T淋巴细胞对CD25和CD69的表达[J].中华皮肤科杂志，2003，36（3）：142-144.
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（收稿日期：2013-08-13） （本文编辑：黄新珍）
【关键词】 外周血白细胞膜CD14； 血浆可溶性CD14； 银屑病； 表达； 皮损
银屑病（Parapsoriasis guttata，PSG）属于一种多发性慢性炎症性皮肤病，往往病程迁延，反复发作。病理研究发现，PSG是在多基因遗传条件下T细胞功能异常导致的免疫性疾病[1-2]。PSG发病机理与免疫力、细菌或病毒感染、遗传因素、神经递质及精神状态等关系密切。细菌感染是诱发PSG加重的一个重要因素。研究表明，革兰阴性杆菌是导致部分慢性炎症的主要致病菌，此类阴性杆菌长期大量生长及死亡，释放、裂解出细胞壁脂多糖即内毒素，能够扩张血管，增高中性粒细胞及血管通透性，并激活补体[3]。内毒素组成主要是脂多糖，脂多糖与内毒素受体膜联CD14（mCD14）、Toll样受体（TLR4）、MD-2等受体复合物相结合，可激活细胞信号传导通路，进而激活核因子KB（NFKB），生成肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8及干扰素γ等炎症因子[4]。此类炎症因子在PSG发病过程中发挥重要作用[5-6]。因此，脂多糖及其信号通路在PSG发病过程扮演重要角色。本研究测定了PSG患者外周血白细胞mCD14及血浆中可溶性CD14（soluble CD14，sCD14）的表达，以分析内毒素信号转导通路激活与PSG的相互关系。
1 资料与方法
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1.2 方法
1.2.1 外周血白细胞表面mCD14表达的检测
1.2.1.1 两组全血标本的采集 两组均采集3 mL静脉血，以乙二胺四乙酸（EDTA）-K2为抗凝剂。
1.2.1.2 直接法免疫荧光标记 按使用说明书及实际样本量配制所需量的试剂。取100 μL EDTA抗凝的人外周静脉血，添加20 μL的荧光抗体抗mCD14-APC，混和均匀，避光孵育30 min。添加2 mL红细胞溶解液并混合均匀，室温条件下孵育10 min，至孵育液完全澄清透明。1000 rpm离心5 min，弃上清，将细胞悬浮在约0.5 mL的4%多聚甲醛溶液中，振荡混匀后以流式细胞仪（美国guava）进行检测。
1.2.1.3 使用同型对照荧光测定阴性范围 完成各通道之间荧光补偿值设置后，依次进行标本检测，作CD14荧光的直方图，应用CellQuest软件对检测结果进行分析。
1.2.2 血浆中sCD14水平的检测
1.2.2.1 血浆标本采集 上述实验过程中剩下的EDTA抗凝血样本，在2000 rpm条件下，离心8 min获得血浆，保存于-80 ℃直至检测。
1.2.2.2 ELISA检测 取出酶标板，每孔中加入100 μL的抗体稀释液。之后添加100 μL的标准品、样品及对照品，混合均匀，每样本作为2个复孔。室温条件下孵育3 h后吸干孔中的液体，加入300 μL洗液洗涤，反复4次。每孔中添加200 μL的sCD14酶结合物，室温条件下孵育l h。反复洗涤3次后，每个孔中添加200 μL的底物，室温条件下孵育30 min。每孔加入50 μL的终止液，30 min内在酶标仪上，于450 nm波长处读取各孔吸光度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流式细胞仪的检测结果 PSG组患者外周血白细胞膜mCD14的表达水平平均为（6.20±2.20）%，其中进行期、静止期分别为（7.30±2.40）%、（4.70±2.20）%，均较健康对照组明显增高 （P<0.01）；且进行期、静止期比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 ELISA法检测结果 PSG组患者外周血白细胞膜sCD14的浓度平均为（1.39±0.38）μg/mL，其中进行期、静止期分别为（1.42±0.39）μg/mL、（1.21±0.44）μg/mL，均较健康对照组显著增高 （P<0.01）。见表1。 表1 银屑病患者组与健康体检对照组外周血白细胞mCD14及sCD14表达水平比较（x±s）
组别 mCD14表达（%） sCD14表达（μg/mL）
PSG组（n=36） 6.20±2.20* 1.39±0.38*
进行期（n=20） 7.30±2.40*△ 1.42±0.39*
静止期（n=16） 4.70±2.20* 1.21±0.44*
健康对照组（n=52） 3.57±0.90 1.07±0.32
*与健康对照组比较，P<0.01；△与静止期比较，P<0.05
3 讨论
之前对细菌感染诱发PSG的研究多集中在革兰阳性杆菌超抗原，如金黄色葡萄球菌肠毒素B、链球菌致热性肠毒素A、中毒性休克蛋白-1等，此类革兰阳性杆菌超抗原能够激活T淋巴细胞，合成不同类型的炎症因子，刺激角质致使细胞增殖，而触发PSG的发生[7]。临床上，笔者经常见到合并革兰阴性杆菌感染诱发的各类慢性炎症PSG患者病情迁延不愈或随炎症程度而加重的现象，肠道和胆道感染、萎缩性胃炎、泌尿生殖炎症等。皮损程度往往随病情的加重而加重，提示此类病灶可能与PSG发病关系密切。内毒素是革兰阴性杆菌的主要致病物质，其成分主要为脂多糖[8]。脂多糖可产生多种强的生理学效应，对宿主先天存在及环境适应性免疫反应均有显著的影响。脂多糖内毒素与细胞膜上的mCD14、Toll样受体4（Toll-likereceptor 4，TLR4）等受体复合物相结合能启动细胞内部的信号转导通路，最终激活NF-KB，通过对基因转录的调节合成大量的细胞因子，包括不同类型的黏附分子、前列腺素、趋化因子及一氧化氮等。不同类型的炎性因子如IL-6、IL-8、ICAM-1、肿瘤坏死因子α、一氧化氮、前列腺素2等均在PSG中高度高表达[9]。有研究报道，PSG患者可能有胆汁酸分泌上的缺陷，可将从肠道吸收内毒素分解代谢为无毒性产物，以去氢胆酸治疗PSG临床疗效较常规疗法更好。总之，怀疑内毒素及其信号传导通路很有可能在PSG发病机制中扮演重要角色[10]。
CD14是脂多糖LPS受体复合物重要成员，TLR4等一同介导LPS跨膜信号转导[11]。CD14属于单核或巨噬细胞表面的一种高度分化的抗原，属于糖蛋白，它有两种存在形式：mCD14及sCD14。mCD14主要存在于细胞膜上，而其表达则主要在单核/巨噬细胞等髓样细胞表面，是单核/巨噬细胞高度分化的典型特征[12-13]。中性粒细胞细胞膜表面也存在少量mCD14。sCD14主要存在于血清中，来源于髓样细胞分泌或mCD14的脱落。人体内CD14分子以sCD14为主要存在形式[14-15]。研究表明，LPS作用后的人外周静脉血单核细胞mCD14的表达水平显著增高；内毒素血症时患者外周血sCD14水平也较健康状态时明显上升，推测CD14的升高提示可能存在感染[16-17]。王琼玉等[18]研究显示，寻常性PSG患者血清及皮损吸疱液中sCD14浓度均较健康人明显上升，经治疗后患者血清sCD14可降至正常。提示PSG患者单核细胞活性异常升高，并进一步推测PSG患者可能出现血清内毒素升高[19-20]。本实验中，PSG组外周血白细胞膜mCD14的表达水平以及进行期、静止期水平均较健康对照组明显增高（P<0.01）；且进行期高于静止期 （P<0.05）。银屑病组患者外周血白细胞膜sCD14的平均浓度及进行期、静止期浓度均较健康对照组显著增高（P<0.01）。本结果与Schopf的相关结论一致，且流式细胞仪测定亦证实PSG患者外周血白细胞表面的mCD14表达量显著上调，表明PSG患者血浆中内毒素浓度很可能是异常增高的[21]。
总之，内毒素及其信号传导通路在PSG发病中起重要作用[22-23]。但对于各种内毒素作用于T淋巴细胞导致角质形成细胞增殖的准确机制，仍需深入的体内、体外相关实验研究[24]。对此领域的进一步研究将有助于进一步探讨PSG发病机制，并为银屑病治疗寻找新的方法[25]。
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（收稿日期：2013-08-13） （本文编辑：黄新珍）