【摘 要】
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【背景】成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas9）已被广泛证实是高效、强大的第三代基因编辑工具，在发现功能基因等领域取得了重要进展，但至今尚无利用该方法挖掘猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic di
【基金项目】
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国家自然科学基金（32272996）； 江苏省杰出青年基金（BK20190003）； 江苏省种业振兴揭榜挂帅项目（JBGS[2021] 024）；
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【背景】成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas9）已被广泛证实是高效、强大的第三代基因编辑工具，在发现功能基因等领域取得了重要进展，但至今尚无利用该方法挖掘猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）宿主基因的报道。【目的】利用CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因，并进行候选基因的初步验证，为培育抗PEDV种猪提供科学参考。【方法】通过CRISPR/Cas9技术构建人肝癌细胞系（Huh-7）全基因组敲除文库，利用PEDV感染Huh-7文库细胞，随后经过高通量测序筛选影响PEDV复制的关键宿主因子，结合基因干扰和检测病毒效价等相关试验对影响PEDV复制的候选基因进行初步验证。【结果】构建了CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因的方法，将富集程度排名靠前的整合素α11（ITGA11）、哺乳动物复制蛋白A2（RPA2）、驱动蛋白家族成员2A（KIF2A）、诱导髓系白血病细胞分化蛋白1（MCL1）、多聚ADP核糖化酶1（PARP1）和囊泡单胺转运蛋白（SLC18A1）基因进行了验证；采用siRNA对上述基因分别进行干扰后，结果与对照组相比，干扰ITGA11可显著降低PEDV猪源靶向细胞IPEC-J2中PEDV-N mRNA、蛋白表达水平及子代病毒滴度。【结论】上述研究表明，基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除文库可作为挖掘PEDV复制相关功能基因的有效工具，ITGA11基因可作为一种制备抗PEDV猪种潜在的靶基因。
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