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摘 要：目的 提高我县疾病预防控制中心（CDC）对常见病原菌的检测能力。方法 按照《卫生防疫细菌检验》何晓青著、GB/T4789、7-2008进行检验。结果 质控盲样为副溶血性弧菌，且与致病性显著相关。结论 鉴定结果及时、准确。本实验室常见病原菌的检测能力进一步巩固和提高。
关键词：病原微生物；质控；盲样；检测能力
Identification and analysis on a blind samples of pathogenic microorganism quality control
FU cui-hua
Center for Disease Control and Prevention of Nanchang County ,JiangXi330200,China.
Abstract:Objective To improve the detection capability of common pathogenic bacteria of CDC in NanChang County.Method Conduct detection according to the sanitation and epidemic prevention bacteria inspection of the HeXiaoqing and GB/T4789、7-2008 .Result The blind sample is Vibio parahemolyticus,and it is highly correlated to pathogenicity.Conclusion The result of identification is just in time and accurate.The detection capability of common pathogenic bacteria had been consolidated and improved further.
Keyword: Pathogenic microorganism; Quality control; Blind sample;Detection capability
微生物质控盲样菌株鉴定既能考查微生物实验室检验结果是否准确可靠，又能快速提升检测人员的业务技术水平[1]。为了保证所提供数据的公正、准确和科学，我们每年定期参加南昌市CDC组织的盲样考核，现将2012年11月的一次微生物盲样考核情况及结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 质控盲样
密封试管装半固态斜面培养物1支。
1.2 培养基和试剂
1.2.1 营养肉汤、营养琼脂、血琼脂、EMB琼脂、WS琼脂、TCBS琼脂、TSA-YE琼脂、三糖铁（TSI）琼脂、半固体琼脂、氧化酶试剂均购自杭州天和微生物试剂有限公司；无菌绵羊全血购自杭州新锐；快速革兰氏染色液和微生物生化鉴定试剂盒购自康泰生物；副溶血性弧菌生化鉴定管（11种×10支）由杭州微生物试剂有限公司提供。上述培养基和试剂均在有效期内使用。
1.2.2 3%Nacl碱性蛋白胨水、嗜盐培养基、我妻氏血琼脂、Hugh-Leifson二氏培养基由实验室自制。
1.4 标准菌种
本次质控使用的标准菌种：ATCC29213金黄色葡萄球菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC9027铜绿假单胞菌。
1.5 按BSL-2级实验室生物安全防护要求进行盲样接种。
1.6 仪器设备型号名称（厂家）
GSP-9270MBE隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、Nikon E200双目生物显微镜（上海双旭电子有限公司）
1.7 检验方法
组织单位发放微生物盲样考核作业指导书、《卫生防疫细菌检验》[2]、GB/T4789、7-2008[3]。
2 菌株鉴定思路与过程
2.1认真阅读微生物盲样考核作业指导书，按照要求进行操作作业指导书要求按GB4789进行检测。
2.2 肉眼观察未知菌斜面生长情况未知菌斜面生长良好、湿润、呈无色半透明，无蔓延生长现象。
2.3 革兰氏染色G-菌，呈杆状、卵圆状等。
2.4 氧化酶试验氧化酶试验阳性。
2.5 接种3支高层半固体和4支营养琼脂斜面，以观察细菌动力、保存菌种及获取生化鉴定所需的足够的菌量。同时接种Hugh-Leifson二氏培养基、TSI琼脂、营养肉汤、3%Nacl碱性蛋白胨水、营养琼脂、血琼脂、EMB琼脂、WS琼脂、TCBS琼脂、TSA-YE琼脂于36.5℃恒温培养24h。结果见表1.
2.6 嗜盐性试验0%（-）、3%（++++、表层形成菌膜）、6%（++）、8%（+）、10%（-）
2.7 确定鉴定
2.7.1副溶血性弧菌生化鉴定管（11种×10支）结果见表2。
注1.培养基均含3.5%Nacl。2.鸟氨酸于36.5℃恒温培养至第4天出现阳性结果
表1 培养基生长情况及菌落形态特征
2.7.2 革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒:按照试剂说明进行操作,结果见表3。
表 3
2.8 神奈川(KP)试验
KP试验阳性：点种菌落周围呈现窄的半透明的β溶血环。
3 结果
3.1 由2.1~2.5提示质控盲样可能为副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,Vp）。
3.2 结合2.1~2.8，该质控盲样为Vp，且与致病性显著相关。
4 讨论
盲样考核是实验室室间质控和能力验证的主要内容之一，在盲样鉴定过程中，我们要利用所有对我们有用的资料,每一步都应用常识来判断[4]，大胆提出假设并按照现行有效的标准进行验证。
在鉴定工作中第一步是得到每个有机体的纯培养，简单的细菌或真菌的最初分类是以形态学性质结合生理学性质特别是对氧的需求和利用碳水化合物（特别是对葡萄糖）的方式为基础的[4]。在常见病原菌的分离中，革兰氏染色、糖代谢试验、氧化酶试验/触酶试验、有无动力即可将盲样鉴定到科或属[2]。本次盲样为G-杆菌、氧化酶阳性、糖代谢为发酵性、有动力，综合这4点即可将质控盲样定为弧菌科或气单胞菌科。仔细阅读组织单位发放的微生物盲样考核作业指导书，了解到病原菌的检测标准范围为GB4789，再根据培养基生长情况及菌落形态特征，我们即可以假定质控盲样为副溶血性弧菌，能后按照GB/T4789、7-2008[3]进行鉴定并验证假设，结果及时、准确。
细菌学检测结果的准确性和可靠性和质量控制有着直接的关系[5-6]，此外，细菌学检测的方式方法也很重要。嗜盐性试验作为弧菌属鉴定的初步试验，在接种时，用接种针挑取菌落，很难控制不同Nacl浓度嗜盐管的接种量，导致结果出现假阳性或假阴性。而用灭菌移液器向每个浓度嗜盐管中接种10~20μl营养肉汤过夜培养物（稀释成相当于0.5号麦氏管浓度），这种方法操作简单，观察结果时准确且不同Nacl浓度嗜盐管混浊度具有可比性。
Vp所产生的耐热直接溶血毒素(thermostabile direct hemolysin,TDH),被认为是Vp的一种主要的毒力因子[7]，由于编码TDH的基因高度表达而产生“神奈川现象”[8]。本次质控盲样Vp试验阳性，因而与致病性显著相关[3、9] 。在考核结束后，对鉴定过程中所产生的任何废弃物均经121℃，15-20分钟高压消毒无害化处理。
定期对实验室开展质量控制考核是实验室能力验证计划的类型之一，也是计量认证和国家实验室认可的特定要求[10]。质控盲样的鉴定过程，就是一个对检验人员、仪器设备、检测方法的选择、培养基和试剂，原始记录规范书写的一个全方位的验证过程，通过对国家标准的仔细阅读与操作，使检验人员对常见病原菌的检测能力进一步巩固和提高。同时也增强了自信，以更好的应对常见病原菌的食物中毒。
参考文献：
[1] 杨献青,何惠娟.微生物质控盲样菌株鉴定的检验思路与质量保证[J].中国卫生检验杂志,2010,20(3):663-664.
[2] 何晓青.卫生防疫细菌检验[M].南昌：新华出版社,1989:167-171.
[3] GB/T4789.7-2008.食品卫生微生物学检验-副溶血性弧菌检验[S].
[4] R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.《伯杰细菌鉴定手册》第八版[M].北京:科学出版社,1984:7-9.
[5] 杨瑞军,张建民.菌种质控结果分析[J].中国公共卫生管理,2010,26(2):226-227.
[6] 谢达禄,王晓凤,肖秀珠.微生物检验实验室质量控制[J].中华全科医学,2011,9(2):302-304.
[7] 苏桂栋,苏建新,聂军.副溶血性弧菌直接溶血毒素和溶血相关毒素的研究进展[J].广东医学杂志,2003,24(12):1378-1380.
[8] 柳增善.食品病原微生物学[M].北京:中国轻工业出版社,2007.
[9] 陈慧燕,洪程基,马雪莲,等.温州市酒店海产品中副溶血性弧菌的分型鉴定及耐药性研究[J].中国卫生检验杂志,2010,20(10):2569-2571.
[10] 昃向君.实验室认可准备与审核工作指南[M].北京:中国标准出版社,2002:89.
作者简介：
付翠华（1973-），女，硕士，副主任医师，主要从事病原微生物检验工作。
关键词：病原微生物；质控；盲样；检测能力
Identification and analysis on a blind samples of pathogenic microorganism quality control
FU cui-hua
Center for Disease Control and Prevention of Nanchang County ,JiangXi330200,China.
Abstract:Objective To improve the detection capability of common pathogenic bacteria of CDC in NanChang County.Method Conduct detection according to the sanitation and epidemic prevention bacteria inspection of the HeXiaoqing and GB/T4789、7-2008 .Result The blind sample is Vibio parahemolyticus,and it is highly correlated to pathogenicity.Conclusion The result of identification is just in time and accurate.The detection capability of common pathogenic bacteria had been consolidated and improved further.
Keyword: Pathogenic microorganism; Quality control; Blind sample;Detection capability
微生物质控盲样菌株鉴定既能考查微生物实验室检验结果是否准确可靠，又能快速提升检测人员的业务技术水平[1]。为了保证所提供数据的公正、准确和科学，我们每年定期参加南昌市CDC组织的盲样考核，现将2012年11月的一次微生物盲样考核情况及结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 质控盲样
密封试管装半固态斜面培养物1支。
1.2 培养基和试剂
1.2.1 营养肉汤、营养琼脂、血琼脂、EMB琼脂、WS琼脂、TCBS琼脂、TSA-YE琼脂、三糖铁（TSI）琼脂、半固体琼脂、氧化酶试剂均购自杭州天和微生物试剂有限公司；无菌绵羊全血购自杭州新锐；快速革兰氏染色液和微生物生化鉴定试剂盒购自康泰生物；副溶血性弧菌生化鉴定管（11种×10支）由杭州微生物试剂有限公司提供。上述培养基和试剂均在有效期内使用。
1.2.2 3%Nacl碱性蛋白胨水、嗜盐培养基、我妻氏血琼脂、Hugh-Leifson二氏培养基由实验室自制。
1.4 标准菌种
本次质控使用的标准菌种：ATCC29213金黄色葡萄球菌、ATCC25922大肠埃希氏菌、ATCC9027铜绿假单胞菌。
1.5 按BSL-2级实验室生物安全防护要求进行盲样接种。
1.6 仪器设备型号名称（厂家）
GSP-9270MBE隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、Nikon E200双目生物显微镜（上海双旭电子有限公司）
1.7 检验方法
组织单位发放微生物盲样考核作业指导书、《卫生防疫细菌检验》[2]、GB/T4789、7-2008[3]。
2 菌株鉴定思路与过程
2.1认真阅读微生物盲样考核作业指导书，按照要求进行操作作业指导书要求按GB4789进行检测。
2.2 肉眼观察未知菌斜面生长情况未知菌斜面生长良好、湿润、呈无色半透明，无蔓延生长现象。
2.3 革兰氏染色G-菌，呈杆状、卵圆状等。
2.4 氧化酶试验氧化酶试验阳性。
2.5 接种3支高层半固体和4支营养琼脂斜面，以观察细菌动力、保存菌种及获取生化鉴定所需的足够的菌量。同时接种Hugh-Leifson二氏培养基、TSI琼脂、营养肉汤、3%Nacl碱性蛋白胨水、营养琼脂、血琼脂、EMB琼脂、WS琼脂、TCBS琼脂、TSA-YE琼脂于36.5℃恒温培养24h。结果见表1.
2.6 嗜盐性试验0%（-）、3%（++++、表层形成菌膜）、6%（++）、8%（+）、10%（-）
2.7 确定鉴定
2.7.1副溶血性弧菌生化鉴定管（11种×10支）结果见表2。
注1.培养基均含3.5%Nacl。2.鸟氨酸于36.5℃恒温培养至第4天出现阳性结果
表1 培养基生长情况及菌落形态特征
2.7.2 革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒:按照试剂说明进行操作,结果见表3。
表 3
2.8 神奈川(KP)试验
KP试验阳性：点种菌落周围呈现窄的半透明的β溶血环。
3 结果
3.1 由2.1~2.5提示质控盲样可能为副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,Vp）。
3.2 结合2.1~2.8，该质控盲样为Vp，且与致病性显著相关。
4 讨论
盲样考核是实验室室间质控和能力验证的主要内容之一，在盲样鉴定过程中，我们要利用所有对我们有用的资料,每一步都应用常识来判断[4]，大胆提出假设并按照现行有效的标准进行验证。
在鉴定工作中第一步是得到每个有机体的纯培养，简单的细菌或真菌的最初分类是以形态学性质结合生理学性质特别是对氧的需求和利用碳水化合物（特别是对葡萄糖）的方式为基础的[4]。在常见病原菌的分离中，革兰氏染色、糖代谢试验、氧化酶试验/触酶试验、有无动力即可将盲样鉴定到科或属[2]。本次盲样为G-杆菌、氧化酶阳性、糖代谢为发酵性、有动力，综合这4点即可将质控盲样定为弧菌科或气单胞菌科。仔细阅读组织单位发放的微生物盲样考核作业指导书，了解到病原菌的检测标准范围为GB4789，再根据培养基生长情况及菌落形态特征，我们即可以假定质控盲样为副溶血性弧菌，能后按照GB/T4789、7-2008[3]进行鉴定并验证假设，结果及时、准确。
细菌学检测结果的准确性和可靠性和质量控制有着直接的关系[5-6]，此外，细菌学检测的方式方法也很重要。嗜盐性试验作为弧菌属鉴定的初步试验，在接种时，用接种针挑取菌落，很难控制不同Nacl浓度嗜盐管的接种量，导致结果出现假阳性或假阴性。而用灭菌移液器向每个浓度嗜盐管中接种10~20μl营养肉汤过夜培养物（稀释成相当于0.5号麦氏管浓度），这种方法操作简单，观察结果时准确且不同Nacl浓度嗜盐管混浊度具有可比性。
Vp所产生的耐热直接溶血毒素(thermostabile direct hemolysin,TDH),被认为是Vp的一种主要的毒力因子[7]，由于编码TDH的基因高度表达而产生“神奈川现象”[8]。本次质控盲样Vp试验阳性，因而与致病性显著相关[3、9] 。在考核结束后，对鉴定过程中所产生的任何废弃物均经121℃，15-20分钟高压消毒无害化处理。
定期对实验室开展质量控制考核是实验室能力验证计划的类型之一，也是计量认证和国家实验室认可的特定要求[10]。质控盲样的鉴定过程，就是一个对检验人员、仪器设备、检测方法的选择、培养基和试剂，原始记录规范书写的一个全方位的验证过程，通过对国家标准的仔细阅读与操作，使检验人员对常见病原菌的检测能力进一步巩固和提高。同时也增强了自信，以更好的应对常见病原菌的食物中毒。
参考文献：
[1] 杨献青,何惠娟.微生物质控盲样菌株鉴定的检验思路与质量保证[J].中国卫生检验杂志,2010,20(3):663-664.
[2] 何晓青.卫生防疫细菌检验[M].南昌：新华出版社,1989:167-171.
[3] GB/T4789.7-2008.食品卫生微生物学检验-副溶血性弧菌检验[S].
[4] R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.《伯杰细菌鉴定手册》第八版[M].北京:科学出版社,1984:7-9.
[5] 杨瑞军,张建民.菌种质控结果分析[J].中国公共卫生管理,2010,26(2):226-227.
[6] 谢达禄,王晓凤,肖秀珠.微生物检验实验室质量控制[J].中华全科医学,2011,9(2):302-304.
[7] 苏桂栋,苏建新,聂军.副溶血性弧菌直接溶血毒素和溶血相关毒素的研究进展[J].广东医学杂志,2003,24(12):1378-1380.
[8] 柳增善.食品病原微生物学[M].北京:中国轻工业出版社,2007.
[9] 陈慧燕,洪程基,马雪莲,等.温州市酒店海产品中副溶血性弧菌的分型鉴定及耐药性研究[J].中国卫生检验杂志,2010,20(10):2569-2571.
[10] 昃向君.实验室认可准备与审核工作指南[M].北京:中国标准出版社,2002:89.
作者简介：
付翠华（1973-），女，硕士，副主任医师，主要从事病原微生物检验工作。