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中图分类号 R917；R94 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）11-1529-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.11.21
摘 要 目的：建立苗药妇肤康喷雾剂的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18，流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（梯度洗脱），检测波长为262 nm，流速为0.6 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。以6′ -羟基-爵床定B为参照，绘制10批样品的HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A版），对10批样品进行相似度评价，确定10批样品的共有峰。采用建立的方法测定10批样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B的含量。结果：10批样品的HPLC指纹图谱有12个共有峰，相似度均大于0.90，其HPLC指纹图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。10批样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量分别为1.64～5.84、0.83～2.78 mg/100 mL。结论：建立的方法操作简便，结果准确可靠，可为妇肤康喷雾剂的质量评价提供参考。
关键词 妇肤康喷雾剂；高效液相色谱法；指纹图谱；6′ -羟基-爵床定B；爵床定B
Study on HPLC Fingerprint of Miao Medicine Fufukang Spray
LIAO Xiu1，XU Jingjing1，2，YANG Yan1，LI Lilang1，WANG Ke3，LI Qiji1，2，YANG Xiaosheng1，2（1.Guizhou Province Key Lab of Chemistry for Natural Products， Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014， China；2.School of Pharmacy， Zunyi Medical College， Guizhou Zunyi 563000， China；3.Guizhou Liangji Pharmaceutical Co. Ltd.， Guizhou Longli 551206， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Miao medicine Fufukang spray. METHODS： The determination was performed on Thermo Hypersil GOLD C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% glacial acetic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 262 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 10 μL. Using 6′ -hydroxyl-justicidin B as reference control， HPLC chromatograms of 10 batches of samples were drawn. Similarity evaluation system software （2004 A edition） of TCM fingerprint was used to evaluate the similarity and determine common peaks of 10 batches of samples. The established method was used to determine the contents of 6′ -hydroxyl-justicidin B and justicidin B in 10 batches of samples. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples with similarity>0.90. HPLC fingerprint showed a good consistency with the control fingerprint. The contents of 6′ -hydroxyl- justicidin B and justicidin B in 10 batches of samples were 1.64-5.84， 0.83-2.78 mg/100 mL， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate， reliable and suitable for quality evaluation of Fufukang spray.
KEYWORDS Fufukang spray； HPLC； Fingerprint； 6′ -hydroxyl-justicidin B； Justicidin B
婦肤康喷雾剂由爵床和千里光两味药材组成，为贵州省妇科用苗药独家品种，具有清热解毒、活血止痛、杀虫止痒的功效，主要用于霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎、外阴炎、皮肤瘙痒等妇科疾病的治疗[1-4]。爵床作为君药，是爵床科植物爵床的干燥全草，其主要成分为爵床定A、爵床定B、Cleistanthin-B、6′ -羟基-爵床定B等为代表的木脂素类成分，在抗肿瘤、抗菌、抗炎、诱导细胞调亡等方面表现出较好的生物活性[5-11]，与该制剂“清热解毒，活血止痛”的功效基本吻合。目前，该制剂及其君药爵床现存标准仅以性状与薄层色谱鉴别进行质量控制，无法全面地反映该制剂质量。笔者在前期工作研究基础上[12]，拟选6′ -羟基-爵床定B和爵床定B为测定指标，对10批妇肤康喷雾剂进行研究，建立了妇肤康喷雾剂高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并测定了其中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量，以期为全面控制和评价该制剂提供参考。 1 材料
1.1 仪器
U3000 HPLC仪，包括二元梯度泵、紫外检测器色谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BS-210S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；AG285电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
1.2 药品与试剂
妇肤康喷雾剂[贵州良济药业有限公司，批号：20150601～201506010（编号：S1～S10），规格：100 mL/瓶]；6′ -羟基-爵床定B对照品（批号：2015011901，纯度：>98%）、爵床定B对照品（批号：2015011902，纯度：>98%）均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室自制，经HPLC、 质谱、核磁共振进行结构鉴定和纯度检测；乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸（B），梯度洗脱（0～15 min，4%A；15～20 min，4%→15%A；20～25 min，15%→20%A；25～30 min，20%→25%A；30～40 min，25%→35%A；40～50 min，35%→60%A；50～55 min，60%→80%A；55～65 min，80%→90%A）；流速：0.6 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：262 nm；进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液 精密称量6′ -羟基-爵床定B、爵床定B对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品溶液。取6′ -羟基-爵床定B单一对照品溶液4 mL、爵床定B单一对照品溶液2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇稀释，定容，得每1 mL分别含6′ -羟基-爵床定B 40 μg、爵床定B 20 μg的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.2 供试品溶液 吸取妇肤康喷雾剂样品适量，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3 空白对照溶液 将等量的甲醇和70%乙醇溶剂混合均匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性试验 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果，在该色谱条件下，6′ -羟基-爵床定B和爵床定B与各杂质峰间均能达到基线分离，分离度>1.5，理论板数按6′ -羟基-爵床定B 计>3 000。空白对照的基线平稳，表明溶剂及流动相对爵床药材的HPLC特征图谱检测基本无干扰。色谱图见图1。
2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 mL，精密配制成每1 mL分别含6′ -羟基-爵床定B 8、16、24、32、40、48 μg/mL和爵床定B 4、8、12、16、20、24 μg/mL的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。线性关系考察结果见表1。
2.3.3 精密度试验 取样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相對峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=6），表明该方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取样品（编号：S1）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=7），表明供试品溶液室温下放置24 h稳定性良好。
2.3.5 重复性试验 取样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 取样品（编号：S1）适量，共6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入6′ -羟基-爵床定B 1.250 0 mg、爵床定B 0.500 0 mg，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。
2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰的相关分析
2.4.1 HPLC指纹图谱的生成及共有峰相关分析 分别取编号为S1～S10样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到10批次喷雾剂样品的HPLC色谱图。将10批样品指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版），以S1号样品图谱为校正图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成10批样品指纹图谱叠加模式（图2）及对照指纹图谱（图3），确定10批样品的共有峰为12个。根据保留时间指认图谱中10号峰为6′ -羟基-爵床定B，12号峰为爵床定B。以10号峰为参照峰，计算其他特征峰相对于10号峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。
3 讨论
笔者前期试验通过对检测波长、流动相、流速、柱温等色谱条件进行优化，对妇肤康喷雾剂样品进行紫外（200～400 nm）全波长扫描，在262 nm波长处出峰较多，且检测成分6′ -羟基-爵床定B和爵床定B在此波长下吸光值最大，故选262 nm为检测波长。随后分别对乙腈-水、甲醇-水、不同浓度的冰醋酸/甲酸-乙腈等流动相进行了前期的预试验，结果显示在相同的条件下，乙腈-水作为流动相分离效果好，但基线不平稳；乙腈-0.2%冰醋酸为流动相，分离效果更好，基线更平稳，峰形更好，最终确定乙腈-0.2%冰醋酸为流动相，在此条件下又分别对流速、柱温等色谱条件进行考察，最终确定色谱条件为262 nm为检测波长、体积流量0.6 mL/min、柱温25 ℃、乙腈-0.2%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱。 通过对10批样品指纹图谱分析，得到不同样品之间的相似度均在0.90以上，并标定了12个共有峰，各个色谱峰的保留时间匹配较好，说明不同批次样品中的化学成分类型一致[14-15]。通过测定样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B的含量发现，10批样品中6′ -羟基-爵床定B含量为1.64～5.84 mg/100 mL，爵床定B含量为0.83～2.78 mg/100 mL，不同批号间两种检测指标的含量存在较大差异，这可能是由于生产原料不稳定引起的。前期研究发现，不同产地爵床药材中成分差异较大，且6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量具有较大差异[12]，建议生产该制剂时，尽量选择同一产地的药材。但是也有可能是由于生产前对样品提取不当或生产线上其他原因引起的，需进一步验证。
综上，本研究所建立的方法操作简便，结果准确可靠，可为妇肤康喷雾剂的质量评价提供参考。
参考文献
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[15] 吴威巍，缪刘萍，王鑫杰.爵床化学成分研究[J].中成药，2013，35（5）：985-988.
（收稿日期：2018-01-11 修回日期：2018-04-11）
（编辑：余庆华）
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.11.21
摘 要 目的：建立苗药妇肤康喷雾剂的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法：色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18，流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（梯度洗脱），检测波长为262 nm，流速为0.6 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。以6′ -羟基-爵床定B为参照，绘制10批样品的HPLC图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A版），对10批样品进行相似度评价，确定10批样品的共有峰。采用建立的方法测定10批样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B的含量。结果：10批样品的HPLC指纹图谱有12个共有峰，相似度均大于0.90，其HPLC指纹图谱与对照指纹图谱具有较好的一致性。10批样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量分别为1.64～5.84、0.83～2.78 mg/100 mL。结论：建立的方法操作简便，结果准确可靠，可为妇肤康喷雾剂的质量评价提供参考。
关键词 妇肤康喷雾剂；高效液相色谱法；指纹图谱；6′ -羟基-爵床定B；爵床定B
Study on HPLC Fingerprint of Miao Medicine Fufukang Spray
LIAO Xiu1，XU Jingjing1，2，YANG Yan1，LI Lilang1，WANG Ke3，LI Qiji1，2，YANG Xiaosheng1，2（1.Guizhou Province Key Lab of Chemistry for Natural Products， Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014， China；2.School of Pharmacy， Zunyi Medical College， Guizhou Zunyi 563000， China；3.Guizhou Liangji Pharmaceutical Co. Ltd.， Guizhou Longli 551206， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Miao medicine Fufukang spray. METHODS： The determination was performed on Thermo Hypersil GOLD C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% glacial acetic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 262 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 10 μL. Using 6′ -hydroxyl-justicidin B as reference control， HPLC chromatograms of 10 batches of samples were drawn. Similarity evaluation system software （2004 A edition） of TCM fingerprint was used to evaluate the similarity and determine common peaks of 10 batches of samples. The established method was used to determine the contents of 6′ -hydroxyl-justicidin B and justicidin B in 10 batches of samples. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples with similarity>0.90. HPLC fingerprint showed a good consistency with the control fingerprint. The contents of 6′ -hydroxyl- justicidin B and justicidin B in 10 batches of samples were 1.64-5.84， 0.83-2.78 mg/100 mL， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate， reliable and suitable for quality evaluation of Fufukang spray.
KEYWORDS Fufukang spray； HPLC； Fingerprint； 6′ -hydroxyl-justicidin B； Justicidin B
婦肤康喷雾剂由爵床和千里光两味药材组成，为贵州省妇科用苗药独家品种，具有清热解毒、活血止痛、杀虫止痒的功效，主要用于霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎、外阴炎、皮肤瘙痒等妇科疾病的治疗[1-4]。爵床作为君药，是爵床科植物爵床的干燥全草，其主要成分为爵床定A、爵床定B、Cleistanthin-B、6′ -羟基-爵床定B等为代表的木脂素类成分，在抗肿瘤、抗菌、抗炎、诱导细胞调亡等方面表现出较好的生物活性[5-11]，与该制剂“清热解毒，活血止痛”的功效基本吻合。目前，该制剂及其君药爵床现存标准仅以性状与薄层色谱鉴别进行质量控制，无法全面地反映该制剂质量。笔者在前期工作研究基础上[12]，拟选6′ -羟基-爵床定B和爵床定B为测定指标，对10批妇肤康喷雾剂进行研究，建立了妇肤康喷雾剂高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并测定了其中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量，以期为全面控制和评价该制剂提供参考。 1 材料
1.1 仪器
U3000 HPLC仪，包括二元梯度泵、紫外检测器色谱工作站（美国Thermo Fisher Scientific公司）；BS-210S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；AG285电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
1.2 药品与试剂
妇肤康喷雾剂[贵州良济药业有限公司，批号：20150601～201506010（编号：S1～S10），规格：100 mL/瓶]；6′ -羟基-爵床定B对照品（批号：2015011901，纯度：>98%）、爵床定B对照品（批号：2015011902，纯度：>98%）均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室自制，经HPLC、 质谱、核磁共振进行结构鉴定和纯度检测；乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸（B），梯度洗脱（0～15 min，4%A；15～20 min，4%→15%A；20～25 min，15%→20%A；25～30 min，20%→25%A；30～40 min，25%→35%A；40～50 min，35%→60%A；50～55 min，60%→80%A；55～65 min，80%→90%A）；流速：0.6 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：262 nm；进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 混合对照品溶液 精密称量6′ -羟基-爵床定B、爵床定B对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品溶液。取6′ -羟基-爵床定B单一对照品溶液4 mL、爵床定B单一对照品溶液2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇稀释，定容，得每1 mL分别含6′ -羟基-爵床定B 40 μg、爵床定B 20 μg的混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.2 供试品溶液 吸取妇肤康喷雾剂样品适量，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.3 空白对照溶液 将等量的甲醇和70%乙醇溶剂混合均匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 系统适用性试验 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果，在该色谱条件下，6′ -羟基-爵床定B和爵床定B与各杂质峰间均能达到基线分离，分离度>1.5，理论板数按6′ -羟基-爵床定B 计>3 000。空白对照的基线平稳，表明溶剂及流动相对爵床药材的HPLC特征图谱检测基本无干扰。色谱图见图1。
2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 mL，精密配制成每1 mL分别含6′ -羟基-爵床定B 8、16、24、32、40、48 μg/mL和爵床定B 4、8、12、16、20、24 μg/mL的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。线性关系考察结果见表1。
2.3.3 精密度试验 取样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相對峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=6），表明该方法精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 取样品（编号：S1）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=7），表明供试品溶液室温下放置24 h稳定性良好。
2.3.5 重复性试验 取样品（编号：S1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以6′ -羟基-爵床定B的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果，12个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<2.0%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 取样品（编号：S1）适量，共6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入6′ -羟基-爵床定B 1.250 0 mg、爵床定B 0.500 0 mg，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。
2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰的相关分析
2.4.1 HPLC指纹图谱的生成及共有峰相关分析 分别取编号为S1～S10样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到10批次喷雾剂样品的HPLC色谱图。将10批样品指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版），以S1号样品图谱为校正图谱，采用多点校正后进行自动匹配，生成10批样品指纹图谱叠加模式（图2）及对照指纹图谱（图3），确定10批样品的共有峰为12个。根据保留时间指认图谱中10号峰为6′ -羟基-爵床定B，12号峰为爵床定B。以10号峰为参照峰，计算其他特征峰相对于10号峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、表4。
3 讨论
笔者前期试验通过对检测波长、流动相、流速、柱温等色谱条件进行优化，对妇肤康喷雾剂样品进行紫外（200～400 nm）全波长扫描，在262 nm波长处出峰较多，且检测成分6′ -羟基-爵床定B和爵床定B在此波长下吸光值最大，故选262 nm为检测波长。随后分别对乙腈-水、甲醇-水、不同浓度的冰醋酸/甲酸-乙腈等流动相进行了前期的预试验，结果显示在相同的条件下，乙腈-水作为流动相分离效果好，但基线不平稳；乙腈-0.2%冰醋酸为流动相，分离效果更好，基线更平稳，峰形更好，最终确定乙腈-0.2%冰醋酸为流动相，在此条件下又分别对流速、柱温等色谱条件进行考察，最终确定色谱条件为262 nm为检测波长、体积流量0.6 mL/min、柱温25 ℃、乙腈-0.2%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱。 通过对10批样品指纹图谱分析，得到不同样品之间的相似度均在0.90以上，并标定了12个共有峰，各个色谱峰的保留时间匹配较好，说明不同批次样品中的化学成分类型一致[14-15]。通过测定样品中6′ -羟基-爵床定B和爵床定B的含量发现，10批样品中6′ -羟基-爵床定B含量为1.64～5.84 mg/100 mL，爵床定B含量为0.83～2.78 mg/100 mL，不同批号间两种检测指标的含量存在较大差异，这可能是由于生产原料不稳定引起的。前期研究发现，不同产地爵床药材中成分差异较大，且6′ -羟基-爵床定B和爵床定B含量具有较大差异[12]，建议生产该制剂时，尽量选择同一产地的药材。但是也有可能是由于生产前对样品提取不当或生产线上其他原因引起的，需进一步验证。
综上，本研究所建立的方法操作简便，结果准确可靠，可为妇肤康喷雾剂的质量评价提供参考。
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（收稿日期：2018-01-11 修回日期：2018-04-11）
（编辑：余庆华）