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摘要：在小麦-单芒山羊草杂交种质鉴定研究中，尚缺乏可同时鉴定小麦和单芒山羊草染色体的细胞遗传学方法。本研究用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色FISH和以（GAA）8为探针的单色FISH分别对小麦-单芒山羊草双二倍体、中国春-单芒山羊草附加系进行分析，建立了可以同时鉴定小麦和单芒山羊草全部染色体的FISH标准核型。同时，利用建立的FISH标准核型在1N附加系自交后代材料中发现了5BS.3BS和5BL.3BL易位，在5N附加系自交后代中发现5NL端部寡聚核苷酸序列删除现象，这为研究染色体结构变异与表型变化的关系等提供了研究材料。此外，还在4N附加系自交后代中发现4B染色体丢失现象，造成该附加系自发形成4N（4B）代换系，为诱导产生涉及4N染色体的小麦-单芒山羊草罗伯逊易位系奠定了基础。
关键词：单芒山羊草；荧光原位杂交；染色体结构变异；代换系
中图分类号：S5121：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0012-07
Abstract So far，the cytogenetic approaches for the identification of wheat-Aegilops uniaristata germplasm are lacking. In the present research， Fluorescence in situ hybridization （FISH） using Oligo-pTa535-1 and Oligo-pSc119.2-1 as probes， and FISH using （GAA）8 as probe are performed on wheat-Ae. uniaristata amphiploid and additions. As a result， a standard FISH pattern was established for the identification of all chromosomes of wheat and Ae. uniaristata simultaneously. Meanwhile， chromosome translocations 5BS.3BS and 5BL.3BL were detected in the self-pollinated 1N addition progenies， and oligo-nucleotide sequence deletion was also detected on chromosome arm 5NL of Ae. uniaristata in the self-pollinated 5N addition progenies， providing important material for researching the relationships between chromosome structure variation and phenotypic changes. Moreover，a spontaneously formed wheat-Ae. uniaristata 4N（4B） substitution line was identified by the established FISH karyotype from the self-pollinated 4N addition progenies， making a solid foundation for further inducing wheat-Ae. uniaristata chromosome translocations with chromosome 4N involved.
Keywords Aegilops uniaristata；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome structure aberration； Substitution line
小麦是我国50%～60%城乡居民的主要口粮，全国年消费量约1.05亿吨，占全球消费量的20%左右。由于人们生活水平和对生活品质的要求不断提高，使得小麦产业不仅要培育和推广高产抗病品种，还要培育优质特色品种，以满足市场的多元化需求。由于小麦白粉病、条锈病和赤霉病等严重影响小麦生产，加上小麦优质特色育种种质资源有限，因此，发掘优异新基因和创制特异种质新资源并将其转移给当前小麦是培育多元化小麦新品种的重要物质基础。
山羊草属物种含有小麦育种所需的抗病抗逆和优质等基因，其中的单芒山羊草抗小麦多种病害[1-4]，具有耐逆性[5]，具有优质育种潜力[6]，是改良小麦的优异基因源。由于小麦与部分山羊草属物种的亲缘关系非常近，如小麦D染色体来源于粗山羊草[7]，小麦B染色体来源于拟斯卑尔脱山羊草[8-10]，因此，小麥与山羊草属部分物种容易杂交成功并获得小麦-山羊草双二倍体/部分双二倍体。将山羊草种质转移给小麦的常规步骤是：山羊草双二倍体/部分双二倍体与小麦杂交回交获得染色体附加系，附加系经染色体工程诱导获得代换系，代换系经染色体工程诱导成罗伯逊易位系，罗伯逊易位系直接应用于小麦育种或再经染色体工程诱导成染色体小片段易位系再应用于小麦育种。目前，我们已获得抗小麦条锈病的小麦-单芒山羊草1N附加系和可显著提高小麦品质的小麦-单芒山羊草4N染色体附加系[11]，然而涉及1N和4N染色体的相应代换系还未获得。
小麦-单芒山羊草双二倍体和全套附加系已经被创制出来[11]，并且单芒山羊草基因组的优异基因也被进行了充分发掘[12]。然而，目前鉴定小麦背景中单芒染色体的方法十分有限。研究发现以寡聚核苷酸（GAA）8为探针的单色荧光原位杂交（FISH）可以对小麦背景中的单芒山羊草进行区分，但是不能鉴定小麦全部染色体[13]。以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色FISH可以有效区分小麦全部A、B和D染色体[14]，但是是否能区分单芒山羊草1N～7N染色体尚未可知。为此，本研究特以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色FISH和以（GAA）8为探针的单色FISH对小麦-单芒山羊草双二倍体和附加系进行分析，以期建立能够同时鉴定清楚小麦及单芒山羊草所有染色体、用于染色体结构变异检测和可广泛应用小麦-单芒山羊草种质资源鉴定的双色-单色顺序FISH方法。 1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2017年在山东省农业科学院作物研究所农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室和电子科技大学生命科学与技术学院植物细胞遗传实验室进行。试验材料小麦中国春（Chinese Spring，简写为CS，2n=6x=42，基因组AABBDD）由电子科技大学生命科学与技术学院李光蓉教授提供。圆锥小麦-单芒山羊草双二倍体（TA3401，2n=6x=42，基因组AABBNN）由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因资源中心Friebe Bernd教授提供。1N～5N附加系和7N附加系由英国John Inne Centre的Steve Reader教授提供。
试验所用探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1、（GAA）8均由成都瑞信生物公司合成，前两者序列同文献[14]。
1.2 染色体制片与原位杂交
将种子置于铺有滤纸且湿润的培养皿中，放入22℃的恒温光照培养箱中。待种子萌动后，将培养皿转到4℃冰箱中放置24 h，之后，放入22℃恒温光照培养箱培养，待种子根尖长至1～2 cm时，剪下根尖，用冰水处理 22～24 h。倒出冰水，用固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，体积比）固定根尖7 d以上，压片备用。染色体压片技术参见文献[15]，荧光原位杂交方法参见文献[14，16]，杂交顺序为先用寡聚核苷酸探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对供试材料染色体制片进行双色荧光原位杂交，照相后洗脱Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1的荧光信号，然后再利用探针（GAA）8对同一细胞进行杂交照相。
2 结果与分析
2.1 小麦-单芒山羊草双二倍体FISH分析
利用探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对圆锥小麦-单芒山羊草双二倍体进行双色荧光原位杂交，结果发现，双色FISH可以一次鉴定清楚圆锥小麦染色体（图1A），剩余7对单芒山羊草染色体信号各不一致（图1A），但无法确定其同源群归属。因为（GAA）8为探针的单色FISH可以一次鉴定清楚单芒山羊草染色体同源群归属[11]，因而本研究对上述双色FISH染色体制片进行信号洗脱，再以（GAA）8对其进行FISH分析，确定单芒山羊草染色体同源群归属（图1B）。
为了更好地描述Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1在单芒山羊草染色体上的杂交信号，笔者对单芒山羊草1N～7N染色体FISH图进行了提取处理（图2）。其中，1N染色體两端都有较强的Oligo-pSc119.2-1信号（绿色），在长臂末端和近末端有Oligo-pTa-535-1信号（红色）；2N染色体短臂末端有较弱的Oligo-pSc119.2-1信号，近着丝粒和长臂亚端部均有很强的Oligo-pSc119.2-1信号，着丝粒处和长臂近末端有Oligo-pTa-535-1信号；3N染色体短臂末端有非常强的Oligo-pSc119.2-1信号，长臂末端、近末端有Oligo-pTa-535-1信号；4N染色体短臂末端、长臂末端和长臂近末端均有很强的Oligo-pSc119.2-1信号；5N染色体长臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂近末端和亚端部均有Oligo-pTa-535-1信号；6N染色体短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂末端具有Oligo-pTa-535-1信号；7N染色体短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1信号，长臂近着丝粒和长臂亚端部有较强的Oligo-pTa-535-1信号。
2.2 小麦-单芒山羊草附加系自交后代材料FISH分析
为了研究小麦-单芒山羊草附加系自交后代染色体结构是否发生变异，本研究利用探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对小麦-单芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代进行原位杂交，结果发现，小麦-单芒山羊草2N、3N、5N和7N附加系中所有小麦染色体杂交信号和文献[14]报道的完全一致，染色体结构未发现变异，且寡聚核苷酸在染色体上的杂交位置及信号也完全一致，然而，1N附加系自交后代中发现了5BS.3BS和5BL.3BL易位（图3A、3B）。小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中发现1对4B染色体丢失，该附加系自发形成了4N（4B）代换系（图3E、3F）。供试的小麦-单芒山羊草附加系中，1N～4N和7N杂交信号和本研究以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针建立的单芒山羊草FISH核型（图2）完全一致。5N染色体在双二倍体中长臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂近末端有Oligo-pTa-535-1信号；而在5N附加系自交后代中，染色体5N长臂末端的Oligo-pSc119.2-1信号丢失（图3C），这说明5N在传递过程中寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列发生了删除。
利用探针（GAA）8对小麦-单芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代进行原位杂交，结果认为除小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中4B染色体丢失外，未发现其它所有小麦和单芒染色体寡聚核苷酸（GAA）8序列删除现象，并且其在染色体上的杂交位置和信号强度均未发生变异（图3B、3D和3F）。
3 讨论与结论
在单芒山羊草染色体鉴定方面，Friebe等[17]、Badaeva等[18]和Gong等[11]先后建立了不同来源的单芒山羊草染色体C分带，提供了鉴定单芒山羊草染色体的细胞遗传学方法，然而，影响该方法稳定性的酸、碱、盐浓度等因素太多，并不适用于所有实验室。Gong等[11]建立了单芒山羊草染色体（GAA）8为探针的FISH核型，然而，该方法仅能鉴定单芒山羊草染色体，但不能鉴定小麦全部染色体，因而，在小麦-单芒山羊草杂交种质鉴定方面不具全面性。虽然单芒山羊草3N染色体特异EST-STS标记[19]、1N染色体麦谷蛋白标记[20]和1N～7N染色体EST-STS、PLUG和COS标记[11]已经建立起来，为检测小麦背景中单芒山羊草染色体提供了检测方法，但仍不能一次性鉴定清楚小麦-单芒山羊草种质的所有染色体。本研究以小麦-单芒山羊草双二倍体为基础，建立了以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的可以同时鉴定小麦和单芒山羊草所有染色体的双色FISH方法，有效弥补上述研究的不足。不仅如此，本研究建立的双色FISH方法不仅可用于发现小麦-单芒山羊草自交后代中的染色体结构变异、序列删除和染色体丢失等现象（图3A～3F），还可以广泛应用于小麦-单芒山羊草种质筛选与鉴定工作中。 创制可用于小麦育种的小麦-外源物种染色体小片段易位系进行小麦遗传改良是全世界小麦种质资源学家的终极追求。小麦-外源物种染色体单体附加[21]和辐射诱变[22]等方法均是获得小麦-外源物种染色体小片段易位系的有效方法。然而，前者在不同物种染色体间易位频率差异大[21，23，24]，后者诱导方法由于必须大量处理材料并且诱变的方向不可控，因此，较多学者还利用先诱导材料获得小麦-外源物种罗伯逊易位系[25-27]，再利用ph1b基因诱导罗伯逊易位系获得小片段易位系的两步法来达到诱导目的[28]。利用上述两步法的关键是获得小麦-外源物种染色体双单倍体，或先获得小麦-外源物种代换系再与普通小麦杂交获得双单倍体。本研究利用建立的单芒山羊草FISH核型从小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中筛选鉴定出了自发产生的4N（4B）代换系。由于单芒山羊草4N染色体导入小麦可以提高小麦面团的稳定时间和形成时间，增加蛋白质和湿面筋含量[12]，因此，小麦-单芒山羊草4N（4B）代换系为诱导获得可用于小麦品质育种的染色体小片段易位系提供了重要的物质基础。
在小麦远缘杂交后代中往往会出现染色体结构变异[29-33]。陈雷等[29]发现1BL/1RS易位染色体在后代传递过程中，可以引起小麦染色体6BS端部缺失和染色体1BL端部缺失。Garg等[30]在小麦Vilmorin27-中间偃麦草附加系的两个衍生系中发现1D染色体的长臂发生断裂缺失；Tang 等[31]和Fu等[32]在小麦-黑麦杂交种发现涉及小麦染色体5A、6A、1B、2B、6B、7B、1D、3D 和7D等染色体的结构变异。Garg等[33]发现小麦-长穗偃麦草1E附加系后代材料1D染色体丢失而自发形成1E（1D）代换系。本研究发现1N附加系自交后代中出现了小麦3B和5B染色体整臂易位，还在小麦-单芒山羊草5N附加系自交后代发现了寡聚核苷酸序列删除现象。除此之外，在4N附加系后代材料发现小麦4B染色体自发丢失现象。本研究发现的小麦-单芒山羊草种质染色体结构变异体为后续研究染色体结构变异与表型关联分析提供了研究素材。
参考文献：
[1]Valkoun J，Hammer K，Kucˇerová D，et al. Disease resistance in the genus Aegilops L.—stem rust，leaf rust，stripe rust，and powdery mildew[J]. Die Kulturpflanze，1985，33（2）：133-153.
[2]McFadden E S，Sears E R. The genome approach in radical wheat breeding[J]. J. Am. Soc. Agron.，1947，39（11）：1011-1026.
[3]Mikhova S. Resistance of Aegilops species to Puccinia striiformis West f. sp. tritici in relation to ploidy and genome composition[J]. Genet. Selekt.，1988， 21（1）：15-20.
[4]Zhang X，Jin Y. Sensitivity to Ptr ToxA and tan spot infection responses in Aegilops/Triticum complex[J]. Can. J. Plant Pathol.，1998，20（4）：415-418.
[5]Iqbal N，Reader S M，Caligari P D，et al. The production and characterization of recombination between chromosome 3N of Aegilops uniaristata and chromosome 3A of wheat[J]. Heredity，2000，84（4）：487-492.
[6]宿振起，張改生，牛娜. 山羊草属不同细胞质对小麦籽粒蛋白含量及组分的影响研究[J]. 西北植物学报，2005，25（6）：1113-1136.
[7]McFadden E S，Sear E R. The origin of Triticum spelta and its free-testing hexapoloid relatives[J]. Heredity，1946，37（4）：107-116.
[8]Feldman M. The origin of cultivated wheat[M]//Bonjean A P，Angus W J. The world wheat book：a history of wheat breeding. Paris：Lavoisier Tech.& Doc.，2001：3-56.
[9]Balint A F，Kovacs G，Sutka J. Origin and taxonomy of wheat in the light of recent research[J]. Acta. Agr. Hung.，2000，48：301-313.
[10]Feldman M，Lupton F G H，Miller T E. Wheats. Triticum spp. （Gramineae-Triticinae）[M]//Smartt J，Simmonds N W. Evolution of crop plants. 2nd edn. Longman Scientific & Technical Press，1995：184-192. [11]Gong W P，Li G R，Zhou J P，et al. Cytogenetic and molecular markers for detecting Aegilops uniaristata chromosomes in a wheat background[J]. Genome， 2014，57（9）：489-497.
[12]宫文萍，楚秀生，韩冉，等. 单芒山羊草染色体组优异基因发掘[J]. 山东农业科学， 2015，47（7）：11-15.
[13]Danilova T V，Friebe B，Gill B S. Single-copy gene fluorescence in situ hybridization and genome analysis：Acc-2 loci mark evolutionary chromosomal rearrangements in wheat[J]. Chromosoma，2012，121（6）：597-611.
[14]Tang Z X，Yang Z J，Fu S L. Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1，pSc119.2，pTa-535，pTa71，CCS1，and pAWRC.1 for FISH analysis[J]. J. Appl. Genet.，2014，55（3）：313-318.
[15]任正隆，张怀琼. 一个改良的染色体C带技术[J]. 四川农业大学学报，1995， 13（1）：1-5.
[16]Zhang H G，Li G R，Li D H，et al. Molecular and cytogenetic characterization of new wheat-Dasypyrum breviaristatum derivatives with post-harvest re-growth habit[J]. Genes，2015，6（4）：1242-1255.
[17]Friebe B，Badaeva E D，Kammer K，et al. Standard karyotypes of Aegilops uniaristata，Ae. mutica，Ae. comosa subspecies comosa and heldreichii （Poaceae）[J]. Pl. Syst. Evol.，1996，202（3/4）：199-210.
[18]Badaeva E D，Dedkova O S，Zoshchuk S A，et al. Comparative analysis of the N-genome in diploid and polyploidy Aegilops species[J]. Chromosome Res.，2011，19（4）：541-548.
[19]劉成，宫文萍，李光蓉，等. 单芒山羊草3N染色体特异EST-STS标记[C]//2012年中国作物学会学术年会论文摘要集. 南昌：2012年中国作物学会学术年会.
[20]韩冉，隋新霞，杨洪美，等. 小麦-近缘物种染色体系的高分子量麦谷蛋白亚基组成及白粉病抗性[J]. 麦类作物学报，2015，35（11）：1494-1501.
[21]任正隆，张怀琼. 小麦-黑麦染色体小片段易位的诱导[J]. 中国科学C辑：生命科学，1997，27（3）：259-263.
[22]Zhang J，Jiang Y， Guo Y L， et al. Identification of novel chromosomal aberrations induced by 60Co-γ-irradiation in wheat-Dasypyrum villosum lines[J]. Int. J. Mol. Sci.，2015，16（12）：29787-29796.
[23]李瑞芬，梁宏霞，赵茂林. 小麦-簇毛麦单体异附加材料外源染色体减数分裂行为的研究[J]. 中国农业科学，2002，35（2）：127-131.
[24]李瑞芬，赵茂林，张敬原. 单体异附加系花药培养创造小麦-中间偃麦草纯合易位系[J]. 西北植物学报，2006，26（1）：28-32.
[25]Liu C，Qi L，Liu W，et al. Development of a set of compensating Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines[J]. Genome，2011，54（10）：836-844.
[26]Liu W X，Jin Y，Rouse M，et al. Development and characterization of wheat-Ae.sersii Robertsonian chromosome conferring resistance to stem rust[J]. Theor. Appl. Genet.，2011，122（8）：1537-1545.
[27]Zhao W C，Qi L L，Gao X，et al. Development and characterization of two new Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines T1DS·1V#3L and T1DL·1V#3S and their effect on grain quality[J]. Euphytica，2010，175（3）：343-350. [28]Liu W X，Rouse M，Friebe B，et al. Discovery and molecular mapping of a new gene conferring resistance to stem rust，Sr53，derived from Aegilops geniculata and characterization of spontaneous translocation stocks with reduced alien chromatin[J]. Chromosome Res.，2011，19（5）：669-682.
[29]陳雷，李萌，王洋洋. 小麦-黑麦1BL/1RS易位系中的染色体结构变异[J]. 麦类作物学报，2015，35（8）：1038-1043.
[30]Garg M，Elamein H M，Tanaka H，et al. Preferential elimination of chromosome 1D from homoeologous group-1 alien addition lines in hexaploid wheat[J]. Genes & Genetic Systems，2007，82（5）：403-408.
[31]Tang Z，Li M，Chen L，et al. New types of wheat chromosomal structural variations in derivatives of wheat-rye hybrids[J]. PLoS ONE，2014，9 （10）：e110282.
[32]Fu S L，Yang M Y，Fei Y Y，et al. Alterations and abnormal mitosis of wheat chromosomes induced by wheat-rye monosomic addition lines[J]. PLoS ONE，2013， 8（7）：e70483.
[33]Garg M，Tanaka H，Ishikawa N. Agropyron elongatum HMW-glutenins have a potential to improve wheat end-product quality through targeted chromosome introgression[J]. Journal of Cereal Science，2009，50（3）：358-363.
关键词：单芒山羊草；荧光原位杂交；染色体结构变异；代换系
中图分类号：S5121：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0012-07
Abstract So far，the cytogenetic approaches for the identification of wheat-Aegilops uniaristata germplasm are lacking. In the present research， Fluorescence in situ hybridization （FISH） using Oligo-pTa535-1 and Oligo-pSc119.2-1 as probes， and FISH using （GAA）8 as probe are performed on wheat-Ae. uniaristata amphiploid and additions. As a result， a standard FISH pattern was established for the identification of all chromosomes of wheat and Ae. uniaristata simultaneously. Meanwhile， chromosome translocations 5BS.3BS and 5BL.3BL were detected in the self-pollinated 1N addition progenies， and oligo-nucleotide sequence deletion was also detected on chromosome arm 5NL of Ae. uniaristata in the self-pollinated 5N addition progenies， providing important material for researching the relationships between chromosome structure variation and phenotypic changes. Moreover，a spontaneously formed wheat-Ae. uniaristata 4N（4B） substitution line was identified by the established FISH karyotype from the self-pollinated 4N addition progenies， making a solid foundation for further inducing wheat-Ae. uniaristata chromosome translocations with chromosome 4N involved.
Keywords Aegilops uniaristata；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome structure aberration； Substitution line
小麦是我国50%～60%城乡居民的主要口粮，全国年消费量约1.05亿吨，占全球消费量的20%左右。由于人们生活水平和对生活品质的要求不断提高，使得小麦产业不仅要培育和推广高产抗病品种，还要培育优质特色品种，以满足市场的多元化需求。由于小麦白粉病、条锈病和赤霉病等严重影响小麦生产，加上小麦优质特色育种种质资源有限，因此，发掘优异新基因和创制特异种质新资源并将其转移给当前小麦是培育多元化小麦新品种的重要物质基础。
山羊草属物种含有小麦育种所需的抗病抗逆和优质等基因，其中的单芒山羊草抗小麦多种病害[1-4]，具有耐逆性[5]，具有优质育种潜力[6]，是改良小麦的优异基因源。由于小麦与部分山羊草属物种的亲缘关系非常近，如小麦D染色体来源于粗山羊草[7]，小麦B染色体来源于拟斯卑尔脱山羊草[8-10]，因此，小麥与山羊草属部分物种容易杂交成功并获得小麦-山羊草双二倍体/部分双二倍体。将山羊草种质转移给小麦的常规步骤是：山羊草双二倍体/部分双二倍体与小麦杂交回交获得染色体附加系，附加系经染色体工程诱导获得代换系，代换系经染色体工程诱导成罗伯逊易位系，罗伯逊易位系直接应用于小麦育种或再经染色体工程诱导成染色体小片段易位系再应用于小麦育种。目前，我们已获得抗小麦条锈病的小麦-单芒山羊草1N附加系和可显著提高小麦品质的小麦-单芒山羊草4N染色体附加系[11]，然而涉及1N和4N染色体的相应代换系还未获得。
小麦-单芒山羊草双二倍体和全套附加系已经被创制出来[11]，并且单芒山羊草基因组的优异基因也被进行了充分发掘[12]。然而，目前鉴定小麦背景中单芒染色体的方法十分有限。研究发现以寡聚核苷酸（GAA）8为探针的单色荧光原位杂交（FISH）可以对小麦背景中的单芒山羊草进行区分，但是不能鉴定小麦全部染色体[13]。以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色FISH可以有效区分小麦全部A、B和D染色体[14]，但是是否能区分单芒山羊草1N～7N染色体尚未可知。为此，本研究特以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的双色FISH和以（GAA）8为探针的单色FISH对小麦-单芒山羊草双二倍体和附加系进行分析，以期建立能够同时鉴定清楚小麦及单芒山羊草所有染色体、用于染色体结构变异检测和可广泛应用小麦-单芒山羊草种质资源鉴定的双色-单色顺序FISH方法。 1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验于2017年在山东省农业科学院作物研究所农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室和电子科技大学生命科学与技术学院植物细胞遗传实验室进行。试验材料小麦中国春（Chinese Spring，简写为CS，2n=6x=42，基因组AABBDD）由电子科技大学生命科学与技术学院李光蓉教授提供。圆锥小麦-单芒山羊草双二倍体（TA3401，2n=6x=42，基因组AABBNN）由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与基因资源中心Friebe Bernd教授提供。1N～5N附加系和7N附加系由英国John Inne Centre的Steve Reader教授提供。
试验所用探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1、（GAA）8均由成都瑞信生物公司合成，前两者序列同文献[14]。
1.2 染色体制片与原位杂交
将种子置于铺有滤纸且湿润的培养皿中，放入22℃的恒温光照培养箱中。待种子萌动后，将培养皿转到4℃冰箱中放置24 h，之后，放入22℃恒温光照培养箱培养，待种子根尖长至1～2 cm时，剪下根尖，用冰水处理 22～24 h。倒出冰水，用固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，体积比）固定根尖7 d以上，压片备用。染色体压片技术参见文献[15]，荧光原位杂交方法参见文献[14，16]，杂交顺序为先用寡聚核苷酸探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对供试材料染色体制片进行双色荧光原位杂交，照相后洗脱Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1的荧光信号，然后再利用探针（GAA）8对同一细胞进行杂交照相。
2 结果与分析
2.1 小麦-单芒山羊草双二倍体FISH分析
利用探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对圆锥小麦-单芒山羊草双二倍体进行双色荧光原位杂交，结果发现，双色FISH可以一次鉴定清楚圆锥小麦染色体（图1A），剩余7对单芒山羊草染色体信号各不一致（图1A），但无法确定其同源群归属。因为（GAA）8为探针的单色FISH可以一次鉴定清楚单芒山羊草染色体同源群归属[11]，因而本研究对上述双色FISH染色体制片进行信号洗脱，再以（GAA）8对其进行FISH分析，确定单芒山羊草染色体同源群归属（图1B）。
为了更好地描述Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1在单芒山羊草染色体上的杂交信号，笔者对单芒山羊草1N～7N染色体FISH图进行了提取处理（图2）。其中，1N染色體两端都有较强的Oligo-pSc119.2-1信号（绿色），在长臂末端和近末端有Oligo-pTa-535-1信号（红色）；2N染色体短臂末端有较弱的Oligo-pSc119.2-1信号，近着丝粒和长臂亚端部均有很强的Oligo-pSc119.2-1信号，着丝粒处和长臂近末端有Oligo-pTa-535-1信号；3N染色体短臂末端有非常强的Oligo-pSc119.2-1信号，长臂末端、近末端有Oligo-pTa-535-1信号；4N染色体短臂末端、长臂末端和长臂近末端均有很强的Oligo-pSc119.2-1信号；5N染色体长臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂近末端和亚端部均有Oligo-pTa-535-1信号；6N染色体短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂末端具有Oligo-pTa-535-1信号；7N染色体短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1信号，长臂近着丝粒和长臂亚端部有较强的Oligo-pTa-535-1信号。
2.2 小麦-单芒山羊草附加系自交后代材料FISH分析
为了研究小麦-单芒山羊草附加系自交后代染色体结构是否发生变异，本研究利用探针Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1对小麦-单芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代进行原位杂交，结果发现，小麦-单芒山羊草2N、3N、5N和7N附加系中所有小麦染色体杂交信号和文献[14]报道的完全一致，染色体结构未发现变异，且寡聚核苷酸在染色体上的杂交位置及信号也完全一致，然而，1N附加系自交后代中发现了5BS.3BS和5BL.3BL易位（图3A、3B）。小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中发现1对4B染色体丢失，该附加系自发形成了4N（4B）代换系（图3E、3F）。供试的小麦-单芒山羊草附加系中，1N～4N和7N杂交信号和本研究以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针建立的单芒山羊草FISH核型（图2）完全一致。5N染色体在双二倍体中长臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信号，长臂近末端有Oligo-pTa-535-1信号；而在5N附加系自交后代中，染色体5N长臂末端的Oligo-pSc119.2-1信号丢失（图3C），这说明5N在传递过程中寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列发生了删除。
利用探针（GAA）8对小麦-单芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代进行原位杂交，结果认为除小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中4B染色体丢失外，未发现其它所有小麦和单芒染色体寡聚核苷酸（GAA）8序列删除现象，并且其在染色体上的杂交位置和信号强度均未发生变异（图3B、3D和3F）。
3 讨论与结论
在单芒山羊草染色体鉴定方面，Friebe等[17]、Badaeva等[18]和Gong等[11]先后建立了不同来源的单芒山羊草染色体C分带，提供了鉴定单芒山羊草染色体的细胞遗传学方法，然而，影响该方法稳定性的酸、碱、盐浓度等因素太多，并不适用于所有实验室。Gong等[11]建立了单芒山羊草染色体（GAA）8为探针的FISH核型，然而，该方法仅能鉴定单芒山羊草染色体，但不能鉴定小麦全部染色体，因而，在小麦-单芒山羊草杂交种质鉴定方面不具全面性。虽然单芒山羊草3N染色体特异EST-STS标记[19]、1N染色体麦谷蛋白标记[20]和1N～7N染色体EST-STS、PLUG和COS标记[11]已经建立起来，为检测小麦背景中单芒山羊草染色体提供了检测方法，但仍不能一次性鉴定清楚小麦-单芒山羊草种质的所有染色体。本研究以小麦-单芒山羊草双二倍体为基础，建立了以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1为探针的可以同时鉴定小麦和单芒山羊草所有染色体的双色FISH方法，有效弥补上述研究的不足。不仅如此，本研究建立的双色FISH方法不仅可用于发现小麦-单芒山羊草自交后代中的染色体结构变异、序列删除和染色体丢失等现象（图3A～3F），还可以广泛应用于小麦-单芒山羊草种质筛选与鉴定工作中。 创制可用于小麦育种的小麦-外源物种染色体小片段易位系进行小麦遗传改良是全世界小麦种质资源学家的终极追求。小麦-外源物种染色体单体附加[21]和辐射诱变[22]等方法均是获得小麦-外源物种染色体小片段易位系的有效方法。然而，前者在不同物种染色体间易位频率差异大[21，23，24]，后者诱导方法由于必须大量处理材料并且诱变的方向不可控，因此，较多学者还利用先诱导材料获得小麦-外源物种罗伯逊易位系[25-27]，再利用ph1b基因诱导罗伯逊易位系获得小片段易位系的两步法来达到诱导目的[28]。利用上述两步法的关键是获得小麦-外源物种染色体双单倍体，或先获得小麦-外源物种代换系再与普通小麦杂交获得双单倍体。本研究利用建立的单芒山羊草FISH核型从小麦-单芒山羊草4N附加系自交后代中筛选鉴定出了自发产生的4N（4B）代换系。由于单芒山羊草4N染色体导入小麦可以提高小麦面团的稳定时间和形成时间，增加蛋白质和湿面筋含量[12]，因此，小麦-单芒山羊草4N（4B）代换系为诱导获得可用于小麦品质育种的染色体小片段易位系提供了重要的物质基础。
在小麦远缘杂交后代中往往会出现染色体结构变异[29-33]。陈雷等[29]发现1BL/1RS易位染色体在后代传递过程中，可以引起小麦染色体6BS端部缺失和染色体1BL端部缺失。Garg等[30]在小麦Vilmorin27-中间偃麦草附加系的两个衍生系中发现1D染色体的长臂发生断裂缺失；Tang 等[31]和Fu等[32]在小麦-黑麦杂交种发现涉及小麦染色体5A、6A、1B、2B、6B、7B、1D、3D 和7D等染色体的结构变异。Garg等[33]发现小麦-长穗偃麦草1E附加系后代材料1D染色体丢失而自发形成1E（1D）代换系。本研究发现1N附加系自交后代中出现了小麦3B和5B染色体整臂易位，还在小麦-单芒山羊草5N附加系自交后代发现了寡聚核苷酸序列删除现象。除此之外，在4N附加系后代材料发现小麦4B染色体自发丢失现象。本研究发现的小麦-单芒山羊草种质染色体结构变异体为后续研究染色体结构变异与表型关联分析提供了研究素材。
参考文献：
[1]Valkoun J，Hammer K，Kucˇerová D，et al. Disease resistance in the genus Aegilops L.—stem rust，leaf rust，stripe rust，and powdery mildew[J]. Die Kulturpflanze，1985，33（2）：133-153.
[2]McFadden E S，Sears E R. The genome approach in radical wheat breeding[J]. J. Am. Soc. Agron.，1947，39（11）：1011-1026.
[3]Mikhova S. Resistance of Aegilops species to Puccinia striiformis West f. sp. tritici in relation to ploidy and genome composition[J]. Genet. Selekt.，1988， 21（1）：15-20.
[4]Zhang X，Jin Y. Sensitivity to Ptr ToxA and tan spot infection responses in Aegilops/Triticum complex[J]. Can. J. Plant Pathol.，1998，20（4）：415-418.
[5]Iqbal N，Reader S M，Caligari P D，et al. The production and characterization of recombination between chromosome 3N of Aegilops uniaristata and chromosome 3A of wheat[J]. Heredity，2000，84（4）：487-492.
[6]宿振起，張改生，牛娜. 山羊草属不同细胞质对小麦籽粒蛋白含量及组分的影响研究[J]. 西北植物学报，2005，25（6）：1113-1136.
[7]McFadden E S，Sear E R. The origin of Triticum spelta and its free-testing hexapoloid relatives[J]. Heredity，1946，37（4）：107-116.
[8]Feldman M. The origin of cultivated wheat[M]//Bonjean A P，Angus W J. The world wheat book：a history of wheat breeding. Paris：Lavoisier Tech.& Doc.，2001：3-56.
[9]Balint A F，Kovacs G，Sutka J. Origin and taxonomy of wheat in the light of recent research[J]. Acta. Agr. Hung.，2000，48：301-313.
[10]Feldman M，Lupton F G H，Miller T E. Wheats. Triticum spp. （Gramineae-Triticinae）[M]//Smartt J，Simmonds N W. Evolution of crop plants. 2nd edn. Longman Scientific & Technical Press，1995：184-192. [11]Gong W P，Li G R，Zhou J P，et al. Cytogenetic and molecular markers for detecting Aegilops uniaristata chromosomes in a wheat background[J]. Genome， 2014，57（9）：489-497.
[12]宫文萍，楚秀生，韩冉，等. 单芒山羊草染色体组优异基因发掘[J]. 山东农业科学， 2015，47（7）：11-15.
[13]Danilova T V，Friebe B，Gill B S. Single-copy gene fluorescence in situ hybridization and genome analysis：Acc-2 loci mark evolutionary chromosomal rearrangements in wheat[J]. Chromosoma，2012，121（6）：597-611.
[14]Tang Z X，Yang Z J，Fu S L. Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1，pSc119.2，pTa-535，pTa71，CCS1，and pAWRC.1 for FISH analysis[J]. J. Appl. Genet.，2014，55（3）：313-318.
[15]任正隆，张怀琼. 一个改良的染色体C带技术[J]. 四川农业大学学报，1995， 13（1）：1-5.
[16]Zhang H G，Li G R，Li D H，et al. Molecular and cytogenetic characterization of new wheat-Dasypyrum breviaristatum derivatives with post-harvest re-growth habit[J]. Genes，2015，6（4）：1242-1255.
[17]Friebe B，Badaeva E D，Kammer K，et al. Standard karyotypes of Aegilops uniaristata，Ae. mutica，Ae. comosa subspecies comosa and heldreichii （Poaceae）[J]. Pl. Syst. Evol.，1996，202（3/4）：199-210.
[18]Badaeva E D，Dedkova O S，Zoshchuk S A，et al. Comparative analysis of the N-genome in diploid and polyploidy Aegilops species[J]. Chromosome Res.，2011，19（4）：541-548.
[19]劉成，宫文萍，李光蓉，等. 单芒山羊草3N染色体特异EST-STS标记[C]//2012年中国作物学会学术年会论文摘要集. 南昌：2012年中国作物学会学术年会.
[20]韩冉，隋新霞，杨洪美，等. 小麦-近缘物种染色体系的高分子量麦谷蛋白亚基组成及白粉病抗性[J]. 麦类作物学报，2015，35（11）：1494-1501.
[21]任正隆，张怀琼. 小麦-黑麦染色体小片段易位的诱导[J]. 中国科学C辑：生命科学，1997，27（3）：259-263.
[22]Zhang J，Jiang Y， Guo Y L， et al. Identification of novel chromosomal aberrations induced by 60Co-γ-irradiation in wheat-Dasypyrum villosum lines[J]. Int. J. Mol. Sci.，2015，16（12）：29787-29796.
[23]李瑞芬，梁宏霞，赵茂林. 小麦-簇毛麦单体异附加材料外源染色体减数分裂行为的研究[J]. 中国农业科学，2002，35（2）：127-131.
[24]李瑞芬，赵茂林，张敬原. 单体异附加系花药培养创造小麦-中间偃麦草纯合易位系[J]. 西北植物学报，2006，26（1）：28-32.
[25]Liu C，Qi L，Liu W，et al. Development of a set of compensating Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines[J]. Genome，2011，54（10）：836-844.
[26]Liu W X，Jin Y，Rouse M，et al. Development and characterization of wheat-Ae.sersii Robertsonian chromosome conferring resistance to stem rust[J]. Theor. Appl. Genet.，2011，122（8）：1537-1545.
[27]Zhao W C，Qi L L，Gao X，et al. Development and characterization of two new Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines T1DS·1V#3L and T1DL·1V#3S and their effect on grain quality[J]. Euphytica，2010，175（3）：343-350. [28]Liu W X，Rouse M，Friebe B，et al. Discovery and molecular mapping of a new gene conferring resistance to stem rust，Sr53，derived from Aegilops geniculata and characterization of spontaneous translocation stocks with reduced alien chromatin[J]. Chromosome Res.，2011，19（5）：669-682.
[29]陳雷，李萌，王洋洋. 小麦-黑麦1BL/1RS易位系中的染色体结构变异[J]. 麦类作物学报，2015，35（8）：1038-1043.
[30]Garg M，Elamein H M，Tanaka H，et al. Preferential elimination of chromosome 1D from homoeologous group-1 alien addition lines in hexaploid wheat[J]. Genes & Genetic Systems，2007，82（5）：403-408.
[31]Tang Z，Li M，Chen L，et al. New types of wheat chromosomal structural variations in derivatives of wheat-rye hybrids[J]. PLoS ONE，2014，9 （10）：e110282.
[32]Fu S L，Yang M Y，Fei Y Y，et al. Alterations and abnormal mitosis of wheat chromosomes induced by wheat-rye monosomic addition lines[J]. PLoS ONE，2013， 8（7）：e70483.
[33]Garg M，Tanaka H，Ishikawa N. Agropyron elongatum HMW-glutenins have a potential to improve wheat end-product quality through targeted chromosome introgression[J]. Journal of Cereal Science，2009，50（3）：358-363.