论文部分内容阅读
摘要：为研究茶皂素的生物活性及对昆虫作用机理，测定了茶皂素对茶尺蠖卵及幼虫的毒性作用。结果表明：施用浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8mg/mL茶皂素后，卵孵化率分别为21.9%、16.2%、18.2%、11.7%、7.7%、6.2%、5.4%、5.9%，随着茶皂素浓度的提高，杀卵作用增强，高浓度茶皂素（>1 mg/mL）对茶尺蠖卵具有较强的杀卵作用。1、2、4、8mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖3龄幼虫并饲养5天后，无幼虫死亡，说明茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫没有明显的触杀作用，对茶尺蠖的直接毒杀活性较弱。不同浓度的茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫均有一定的拒食作用，随着浓度的增加，拒食效果增强，4、8 mg/mL的茶皂素拒食作用较强，分别达到80.0%、85.7%。取食过茶皂素的3龄、4龄、5龄幼虫虫体长度和重量与未取食的没有明显差异，饲喂8 mg/mL及以下浓度荼皂素的茶尺蠖生长发育均未受到明显影响。
关键词：茶皂素；茶尺蠖；拒食作用
中图分类号：S435.711 文献标志码：A 论文编号：cias15090009
0.引言
茶皂素（Tea Saponin）是五环三萜类皂苷物质，在山茶科（Theacease）山茶属（Camellia）植物中含量非常丰富，目前已从中分离出多种不同结构的茶皂素，茶树种子皂素E1和E2，E3、E4、E5、E6和E7，E10、E11、E12、E13和G2；阿萨姆茶籽和叶片皂素A、B、C、D、F、G、H、I和J；茶花皂素。茶皂素分子结构中含有亲水性和亲油性的2种活性基团，由于其特殊的化学结构，在抗过敏、细胞损伤保护、去污、医药等方面具有良好的活性，也是一种天然的非离子型表面活性剂，可以增加某些农药在作物叶片上的沉积量，增强药效。据胡绍海等的研究，茶皂素与灭多威、功夫菊酯、哒螨灵等乳油型农药中配伍使用，增效倍数为6.33-6.18，并能减少50%-75%农药用量，有利于环境保护。茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖2龄幼虫增效5.68-11.10倍，达到相同的使用效果可减少雷公藤用量85%以上；对茶尺蠖4龄幼虫增效1.00-6.91倍，减少雷公藤用量50%以上。王小艺等认为，茶皂素降低了药液的表面张力，使药液的液滴在植物和害虫的体表接触角有所降低，从而提高了药液在靶标体表的沉积量，减少农药的损失，提高了药效。此外，茶皂素对菜籽蝶幼虫体内解毒酶和消化酶的影响可能是其对农药增效的一个重要因素。可以推测，茶皂素对农药的增效作用不仅与表面活性有关，还与其生物活性对害虫的作用途径相关。
近年来研究表明，茶皂素对菜粉蝶低龄幼虫有较好的杀伤效果。25%茶皂素TS-D水剂500倍液，室内校正防治效果达83.9%；田间校正防治效果74%。黄继轸等报道了其对菜青虫有一定的胃毒和忌避作用，且取食茶皂素的菜青虫化蛹提前。但王小艺等研究结果表明，取食过茶皂素的菜青虫由于生长发育被抑制，化蛹延迟，这与黄继轸等所得结果差异较大，且发现拒食是茶皂素对菜青虫的主要作用方式，在高浓度（>20000 mg/L）下对4龄幼虫具有触杀作用，而且还表现出一定的内吸作用，这在防治应用上具有重大的意义。茶皂素对家蝇3龄幼虫具有很高的浸杀活性，对其化蛹率具有一定的抑制作用，且随茶皂素浓度的升高其抑制作用越明显，但对其羽化率无显著影响。由于上述研究结果之间存在差异，因此茶皂素对害虫确切的毒性作用有待深入研究。提取茶皂素的资源在中国极为丰富，开发利用好这类资源，对于提高废物综合利用价值、保护环境以及发展有机农业等方面，都具有重要的意义。本研究利用茶皂素的生物活性，探究其对茶尺蠖幼虫和卵的毒杀作用，旨在促进茶皂素在茶树病虫害防治上的开发与利用。
1.材料与方法
1.1茶尺蠖的室内饲养
第一代茶尺蠖幼虫来源于安徽省农业科学院茶叶研究所试验茶园，采用茶树鲜叶方法室内饲养茶尺蠖。选取3龄初期幼虫饥饿2 h供试。试验中所用鲜叶均取自茶树品种‘凫早2号’。
1.2试剂
茶皂素（95%）购自长沙睿鼎生物科技有限公司；100 mg/mL茶皂素溶液用少量20%乙醇溶解后用蒸馏水定容；取不同体积100 mg/mL茶皂素溶液用水稀释定容，配制成不同浓度工作液。
1.3试验方法
1.3.1杀卵作用 设8个处理组（0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。每个处理为同一天产的20粒卵。将卵放到载玻片上，用移液器点滴40 gL药剂，再将载玻片放入底部垫有保湿滤纸的培养皿中，用保鲜膜封口扎孔透气，每天观察卵的孵化数，每个处理重复3次，取平均值，计算孵化率，见公式（1）。
1.3.2触杀作用 设4个处理组（1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。每个处理取15头大小一致的茶尺蠖3龄幼虫，放入同一个垫有保湿滤纸的培养皿中。所有培养皿中均放进嫩度一致的茶鲜叶。处理组每头虫体点滴2uL不同浓度茶皂素溶液，对照组点滴等量的蒸馏水。饲养3天，每天记录幼虫的死亡数，考察茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫的触杀作用，每个处理重复3次，取平均值，计算触杀率，见公式（2）。
1.3.3拒食作用 采用浸叶法，设4个处理组（1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。取10头生长一致的茶尺蠖3龄幼虫。用打孔器（d=10 mm）将茶叶打孔，将叶碟浸入不同浓度的茶皂素溶液10 s后取出，自然晾干，饲喂幼虫，每个处理的叶碟数量相同。饲喂48 h后，用数码相机拍下剩余的叶碟，用Photoshop软件处理后计算拒食效果，每个处理重复3次，取平均值，计算拒食率，见公式（3）。
1.3.4茶皂素对茶尺蠖生长的抑制作用 设8个处理组（0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。取10头生长一致的茶尺蠖2龄幼虫。用打孔器（d=10 mm）将茶叶打孔，将叶碟浸入不同浓度的茶皂素溶液10 s后取出，自然晾干，饲喂幼虫，每个处理的叶碟数量相同。饲喂3天后，用不含茶皂素溶液的新鲜叶片继续饲喂至化蛹，期间测量3龄、4龄、5龄虫体长度和重量。 1.3.5数据分析 采用Excel进行数据处理分析。
2.结果与分析
2.1杀卵作用
结果表明（图1），不同浓度茶皂素对茶尺蠖卵均有一定的杀伤作用，随着茶皂素浓度的提高，杀伤作用增强。高浓度茶皂素（>1 mg/mL）对茶尺蠖卵具有较强的杀伤作用，1 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率仅为9.3%，与对照相比，孵化率下降了39%。茶皂素浓度大于2 mg/mL时，杀卵效果趋于稳定，2、4、8 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率均在6.0%左右。
2.2触杀作用
1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖并饲养3天后，所有处理无幼虫死亡，说明茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫没有明显的触杀作用，茶皂素对茶尺蠖的直接毒杀活性较弱。
2.3拒食作用
茶皂素处理叶片后，随着浓度的增加，试虫取食率减少，两者相关性达到了0.9208（图2），说明不同浓度的茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫均有一定的拒食作用，茶皂素浓度增加，拒食效果提高，茶皂素浓度4、8 mg/mL时拒食作用较强，分别达到80.0%、85.7%。
2.4茶皂素对茶尺蠖生长抑制作用
取食茶皂素后的茶尺蠖生长发育速度与未取食的没有明显差异，2龄幼虫至化蛹的时间约10天。另外，取食过茶皂素的3龄、4龄、5龄幼虫虫体长度和重量与未取食的没有明显差异（表1），说明在一定浓度内，饲喂8 mg/mL及以下浓度茶皂素的茶尺蠖的生长发育均未受到明显影响。
3.结论
茶皂素对茶尺蠖卵的直接毒杀活性较强，2、4、8 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率均在6.0%左右。茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫没有明显的触杀作用，说明茶皂素对茶尺蠖的直接毒杀活性较弱。茶皂素对茶尺蠖在无致死活性时，对茶尺蠖仍有很好的拒食作用，茶皂素浓度为4、8 mg/mL拒食作用较强，分别达到80.0%、85.7%，因此短时间施用茶皂素对于茶尺蠖幼虫主要是拒避作用而不是毒杀作用。
4.讨论
茶皂素本身对某些害虫具有较强的拒食活性，如菜青虫、小菜蛾等，可能导致害虫因拒食后取食量较少而生长发育不良，表现为化蛹时间延迟，蛹的长度、宽度和体重均明显减少，且随茶皂素的质量浓度升高抑制越强烈。本研究中饲喂茶皂素3天后，继续饲喂新鲜叶片，不同龄期的茶尺蠖幼虫虫体长度、重量与化蛹时间未取食的没有明显差异，可能由于茶树叶片内含有一定量的茶皂素，而茶尺蠖主要以茶树鲜叶为食，造成茶尺蠖对茶皂素有一定的抗性。
本研究中茶皂素浓度为4、8 mg/mL时拒食作用分别达到80.0%、85.7%，没有触杀效果，说明了茶皂素对茶尺蠖幼虫主要是拒避作用而不是毒杀作用。董道青等研究茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖幼虫的增效作用中，发现利用1、2、4 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖2龄幼虫后第7天，对茶尺蠖2龄幼虫的校正死亡率在37.84%以下，且不同剂量间无显著差异，说明茶皂素本身对茶尺蠖幼虫的毒杀作用不大。本研究也取得了类似的结果，8 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖3龄幼虫并饲养3天后，无幼虫死亡，所以茶皂素对茶尺蠖没有明显的毒杀作用，且短时间内食用较高浓度的茶皂素，施药期过后继续取食新鲜茶树叶片，对茶尺蠖幼虫生长发育也没有抑制作用，死亡率为零可能是由于茶尺蠖龄期大和处理时间短造成的。
茶尺蠖从幼虫至化蛹一般要有6个龄期，本研究只采用茶尺蠖3龄幼虫作为试验对象，对其他龄期的幼虫、处理时间等将会做进一步的探究。由于茶皂素对茶尺蠖幼虫有强烈的拒避作用，在茶尺蠖初发期（1-3龄），能否考虑使用一定浓度的茶皂素溶液喷施于茶树上，短期内干扰茶尺蠖的取食和生长发育，减弱其生长活力，然后再喷施农药，是否能够提高农药的药效或减少农药的使用量，也是值得研究的问题。
关键词：茶皂素；茶尺蠖；拒食作用
中图分类号：S435.711 文献标志码：A 论文编号：cias15090009
0.引言
茶皂素（Tea Saponin）是五环三萜类皂苷物质，在山茶科（Theacease）山茶属（Camellia）植物中含量非常丰富，目前已从中分离出多种不同结构的茶皂素，茶树种子皂素E1和E2，E3、E4、E5、E6和E7，E10、E11、E12、E13和G2；阿萨姆茶籽和叶片皂素A、B、C、D、F、G、H、I和J；茶花皂素。茶皂素分子结构中含有亲水性和亲油性的2种活性基团，由于其特殊的化学结构，在抗过敏、细胞损伤保护、去污、医药等方面具有良好的活性，也是一种天然的非离子型表面活性剂，可以增加某些农药在作物叶片上的沉积量，增强药效。据胡绍海等的研究，茶皂素与灭多威、功夫菊酯、哒螨灵等乳油型农药中配伍使用，增效倍数为6.33-6.18，并能减少50%-75%农药用量，有利于环境保护。茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖2龄幼虫增效5.68-11.10倍，达到相同的使用效果可减少雷公藤用量85%以上；对茶尺蠖4龄幼虫增效1.00-6.91倍，减少雷公藤用量50%以上。王小艺等认为，茶皂素降低了药液的表面张力，使药液的液滴在植物和害虫的体表接触角有所降低，从而提高了药液在靶标体表的沉积量，减少农药的损失，提高了药效。此外，茶皂素对菜籽蝶幼虫体内解毒酶和消化酶的影响可能是其对农药增效的一个重要因素。可以推测，茶皂素对农药的增效作用不仅与表面活性有关，还与其生物活性对害虫的作用途径相关。
近年来研究表明，茶皂素对菜粉蝶低龄幼虫有较好的杀伤效果。25%茶皂素TS-D水剂500倍液，室内校正防治效果达83.9%；田间校正防治效果74%。黄继轸等报道了其对菜青虫有一定的胃毒和忌避作用，且取食茶皂素的菜青虫化蛹提前。但王小艺等研究结果表明，取食过茶皂素的菜青虫由于生长发育被抑制，化蛹延迟，这与黄继轸等所得结果差异较大，且发现拒食是茶皂素对菜青虫的主要作用方式，在高浓度（>20000 mg/L）下对4龄幼虫具有触杀作用，而且还表现出一定的内吸作用，这在防治应用上具有重大的意义。茶皂素对家蝇3龄幼虫具有很高的浸杀活性，对其化蛹率具有一定的抑制作用，且随茶皂素浓度的升高其抑制作用越明显，但对其羽化率无显著影响。由于上述研究结果之间存在差异，因此茶皂素对害虫确切的毒性作用有待深入研究。提取茶皂素的资源在中国极为丰富，开发利用好这类资源，对于提高废物综合利用价值、保护环境以及发展有机农业等方面，都具有重要的意义。本研究利用茶皂素的生物活性，探究其对茶尺蠖幼虫和卵的毒杀作用，旨在促进茶皂素在茶树病虫害防治上的开发与利用。
1.材料与方法
1.1茶尺蠖的室内饲养
第一代茶尺蠖幼虫来源于安徽省农业科学院茶叶研究所试验茶园，采用茶树鲜叶方法室内饲养茶尺蠖。选取3龄初期幼虫饥饿2 h供试。试验中所用鲜叶均取自茶树品种‘凫早2号’。
1.2试剂
茶皂素（95%）购自长沙睿鼎生物科技有限公司；100 mg/mL茶皂素溶液用少量20%乙醇溶解后用蒸馏水定容；取不同体积100 mg/mL茶皂素溶液用水稀释定容，配制成不同浓度工作液。
1.3试验方法
1.3.1杀卵作用 设8个处理组（0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。每个处理为同一天产的20粒卵。将卵放到载玻片上，用移液器点滴40 gL药剂，再将载玻片放入底部垫有保湿滤纸的培养皿中，用保鲜膜封口扎孔透气，每天观察卵的孵化数，每个处理重复3次，取平均值，计算孵化率，见公式（1）。
1.3.2触杀作用 设4个处理组（1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。每个处理取15头大小一致的茶尺蠖3龄幼虫，放入同一个垫有保湿滤纸的培养皿中。所有培养皿中均放进嫩度一致的茶鲜叶。处理组每头虫体点滴2uL不同浓度茶皂素溶液，对照组点滴等量的蒸馏水。饲养3天，每天记录幼虫的死亡数，考察茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫的触杀作用，每个处理重复3次，取平均值，计算触杀率，见公式（2）。
1.3.3拒食作用 采用浸叶法，设4个处理组（1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。取10头生长一致的茶尺蠖3龄幼虫。用打孔器（d=10 mm）将茶叶打孔，将叶碟浸入不同浓度的茶皂素溶液10 s后取出，自然晾干，饲喂幼虫，每个处理的叶碟数量相同。饲喂48 h后，用数码相机拍下剩余的叶碟，用Photoshop软件处理后计算拒食效果，每个处理重复3次，取平均值，计算拒食率，见公式（3）。
1.3.4茶皂素对茶尺蠖生长的抑制作用 设8个处理组（0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液）和1个对照组（蒸馏水）。取10头生长一致的茶尺蠖2龄幼虫。用打孔器（d=10 mm）将茶叶打孔，将叶碟浸入不同浓度的茶皂素溶液10 s后取出，自然晾干，饲喂幼虫，每个处理的叶碟数量相同。饲喂3天后，用不含茶皂素溶液的新鲜叶片继续饲喂至化蛹，期间测量3龄、4龄、5龄虫体长度和重量。 1.3.5数据分析 采用Excel进行数据处理分析。
2.结果与分析
2.1杀卵作用
结果表明（图1），不同浓度茶皂素对茶尺蠖卵均有一定的杀伤作用，随着茶皂素浓度的提高，杀伤作用增强。高浓度茶皂素（>1 mg/mL）对茶尺蠖卵具有较强的杀伤作用，1 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率仅为9.3%，与对照相比，孵化率下降了39%。茶皂素浓度大于2 mg/mL时，杀卵效果趋于稳定，2、4、8 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率均在6.0%左右。
2.2触杀作用
1、2、4、8 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖并饲养3天后，所有处理无幼虫死亡，说明茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫没有明显的触杀作用，茶皂素对茶尺蠖的直接毒杀活性较弱。
2.3拒食作用
茶皂素处理叶片后，随着浓度的增加，试虫取食率减少，两者相关性达到了0.9208（图2），说明不同浓度的茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫均有一定的拒食作用，茶皂素浓度增加，拒食效果提高，茶皂素浓度4、8 mg/mL时拒食作用较强，分别达到80.0%、85.7%。
2.4茶皂素对茶尺蠖生长抑制作用
取食茶皂素后的茶尺蠖生长发育速度与未取食的没有明显差异，2龄幼虫至化蛹的时间约10天。另外，取食过茶皂素的3龄、4龄、5龄幼虫虫体长度和重量与未取食的没有明显差异（表1），说明在一定浓度内，饲喂8 mg/mL及以下浓度茶皂素的茶尺蠖的生长发育均未受到明显影响。
3.结论
茶皂素对茶尺蠖卵的直接毒杀活性较强，2、4、8 mg/mL茶皂素处理后卵孵化率均在6.0%左右。茶皂素对茶尺蠖3龄幼虫没有明显的触杀作用，说明茶皂素对茶尺蠖的直接毒杀活性较弱。茶皂素对茶尺蠖在无致死活性时，对茶尺蠖仍有很好的拒食作用，茶皂素浓度为4、8 mg/mL拒食作用较强，分别达到80.0%、85.7%，因此短时间施用茶皂素对于茶尺蠖幼虫主要是拒避作用而不是毒杀作用。
4.讨论
茶皂素本身对某些害虫具有较强的拒食活性，如菜青虫、小菜蛾等，可能导致害虫因拒食后取食量较少而生长发育不良，表现为化蛹时间延迟，蛹的长度、宽度和体重均明显减少，且随茶皂素的质量浓度升高抑制越强烈。本研究中饲喂茶皂素3天后，继续饲喂新鲜叶片，不同龄期的茶尺蠖幼虫虫体长度、重量与化蛹时间未取食的没有明显差异，可能由于茶树叶片内含有一定量的茶皂素，而茶尺蠖主要以茶树鲜叶为食，造成茶尺蠖对茶皂素有一定的抗性。
本研究中茶皂素浓度为4、8 mg/mL时拒食作用分别达到80.0%、85.7%，没有触杀效果，说明了茶皂素对茶尺蠖幼虫主要是拒避作用而不是毒杀作用。董道青等研究茶皂素对雷公藤乳油防治茶尺蠖幼虫的增效作用中，发现利用1、2、4 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖2龄幼虫后第7天，对茶尺蠖2龄幼虫的校正死亡率在37.84%以下，且不同剂量间无显著差异，说明茶皂素本身对茶尺蠖幼虫的毒杀作用不大。本研究也取得了类似的结果，8 mg/mL茶皂素溶液处理茶尺蠖3龄幼虫并饲养3天后，无幼虫死亡，所以茶皂素对茶尺蠖没有明显的毒杀作用，且短时间内食用较高浓度的茶皂素，施药期过后继续取食新鲜茶树叶片，对茶尺蠖幼虫生长发育也没有抑制作用，死亡率为零可能是由于茶尺蠖龄期大和处理时间短造成的。
茶尺蠖从幼虫至化蛹一般要有6个龄期，本研究只采用茶尺蠖3龄幼虫作为试验对象，对其他龄期的幼虫、处理时间等将会做进一步的探究。由于茶皂素对茶尺蠖幼虫有强烈的拒避作用，在茶尺蠖初发期（1-3龄），能否考虑使用一定浓度的茶皂素溶液喷施于茶树上，短期内干扰茶尺蠖的取食和生长发育，减弱其生长活力，然后再喷施农药，是否能够提高农药的药效或减少农药的使用量，也是值得研究的问题。