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摘 要 花色苷是植物中广泛存在的一类水溶性色素，是一种安全、无毒的天然色素，在食品添加剂和保健食品方面具有广阔的应用前景。黑桃果皮和果肉均乌黑发紫、黑里透红，花色苷含量较高。以花色苷提取率为考察指标，利用单因素试验和正交试验分析了料液比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数等4个因素对黑桃花色苷提取率的影响，得到最优工艺条件为提取温度70 ℃，料液比1∶15，乙醇体积分数50%，提取4 h，黑桃花色苷提取率可达93.87 mg/100 g。
关键词 黑桃;花色苷;提取工艺;单因素试验;正交试验
中图分类号：S662.1;TS202.1 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.22.028
花色苷是植物中广泛存在的一类水溶性色素，主要分布于花和果实的表皮细胞中，使植物的花和果实呈现出红色、紫色、蓝色等多种色彩[1-3]。花色苷在结构上属于类黄酮化合物，是一类次生代谢产物，其在植物生长、发育和防御中起到重要作用，尤其是在清除自由基方面[4-5]。此外，花色苷还具有抗炎、抗氧化、抗癌、治疗心血管疾病等作用[6]。花色苷作为一种安全、无毒的天然色素，在食品添加剂和保健食品方面具有广阔的应用前景。
桃属于蔷薇科李属，拥有丰富的种质资源。果肉颜色是评价桃种质资源的一个重要指标，根据感官判定，可分为白色、黄色、绿色、红色[7]。黑桃又名乌桃，果皮和果肉均乌黑发紫、黑里透红，具有很高的营养价值。研究表明，桃果肉呈现红色的主要原因就是花色苷的存在，花色苷含量与桃果肉红色深浅之间也具有相关性。本文以花色苷提取率为考察指标，利用单因素试验和正交试验研究黑桃花色苷提取工艺，为黑桃花色苷的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料、仪器
试验材料：黑桃材料取自江苏省南京市栖霞区八卦洲街道桃园。无水乙醇、盐酸均为国产分析纯。
试验仪器：HH·S21-4-S恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）、离心机（Eppendorf）、UV1600PC分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。
1.2 花色苷提取与检测
取成熟的黑桃果实，称取一定质量的黑桃材料，按照设定的料液比加入酸性乙醇（0.1% HCl）溶液，在恒温水浴锅中按照设定的提取温度提取一定时间，将所得提取液12 000 rpm下离心10 min，取上清液，在紫外分光光度计下测定530 nm处的吸光值，通过计算公式求得花色苷含量。
花色苷提取率（mg/100 g）=A530×V×n×100/（98.2×M）
（1）
式（1）中，A530为花色苷在530 nm处的吸光值，V为提取液体积（mL），n为测量时的稀释倍数，98.2为花色苷在530 nm波长处的平均消光系数，M为提取物质量（g）。
1.3 单因素试验
1.3.1 不同料液比条件下花色苷提取
设置料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，提取时间3 h，提取温度50 ℃，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.2 不同提取时间条件下花色苷提取
设置提取时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，料液比1∶15，提取温度50 ℃，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.3 不同提取温度条件下花色苷提取
设置提取温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，料液比1∶15，提取时间3 h，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.4 不同乙醇体积分数条件下花色苷提取
设置乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%，料液比1∶15，提取时间3 h，提取温度50 ℃，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.4 正交试验
经过单因素试验分析，分别去除黑桃花色苷提取料液比、提取时间、提取温度、乙醇體积分数等4个因素中结果最差的一个条件，将剩余的4个水平按照L16（44）进行正交试验，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
2 结果与分析
2.1 料液比对黑桃花色苷提取率的影响
不同料液比条件下花色苷提取结果表明（见图1）：随着料液比的减小，黑桃花色苷提取率先升高后降低;料液比为1∶20时，花色苷提取率最高;料液比为1∶5时，花色苷提取率最低。
2.2 提取时间对黑桃花色苷提取率的影响
不同提取时间条件下花色苷提取结果表明（见图2）：随着提取时间的增加，黑桃花色苷提取率逐渐出现小幅度升高，但整体水平变化不大。
2.3 提取温度对黑桃花色苷提取率的影响
不同提取温度条件下花色苷提取结果表明（见图3）：随着提取温度的升高，黑桃花色苷提取率逐渐提高;提取温度为70 ℃时，花色苷提取率最高。
2.4 乙醇体积分数对黑桃花色苷提取率的影响
不同乙醇体积分数条件下花色苷提取结果表明（见图4）：随着乙醇体积分数的增加，黑桃花色苷提取率逐渐下降;当乙醇体积分数为50%时，花色苷提取率最高。
2.5 正交试验
经过单因素试验分析，分别去除黑桃花色苷提取料液比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数4个因素中结果最差的一个条件，将剩余的4个水平按照L16（44）进行正交验设计，正交因素水平设计如表1所示。 正交试验结果表明，在黑桃花色苷提取过程中影响花色苷提取率的四个因素主次顺序为：提取温度>料液比>乙醇体积分数>提取时间（见表2）。为了进一步提高试验结果的科学性和准确性，对上述试验结果进行方差分析（见表3），结果显示FC>Fα=0.01，FA>Fα=0.05，FD>Fα=0.05，FB 3 小结与讨论
桃拥有丰富的种质资源，根据果肉颜色的感官判断，可分为白色、黄色、绿色和红色。花色苷是使桃果肉呈现红色的主要因素，大量研究表明桃中花色苷种类主要为矢车菊-3-葡萄糖苷，此外，在一些红肉桃品种中还鉴定到矢车菊-3-芸香糖苷[7]。花色苷含量是判定红肉桃的一个重要指标，赵玉等测定了68份桃品种果肉花色苷含量并将其划分为5个等级，结合感官判定，将含量20 mg/100 g定为红肉桃的划分临界点[7]。本研究中在最优提取工艺条件下测得黑桃花色苷含量为93.87 mg/100 g，远高于已报道的红肉桃花色苷含量判定标准。
植物花色苷有多种提取方法，包括溶剂法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界CO2提取法、深晶低共熔溶剂法等[8-11]。其中溶剂法操作简单、成本低廉，因而在生产中应用最为广泛。溶剂法提取花色苷常用的溶剂有甲醇、乙醇、酸化水、酸化乙醇等[8]，在食品行业中，综合考虑提取率、成本、安全性等多方面因素，酸化乙醇具有安全、高效的优点，因而应用最为广泛。本文利用单因素试验和正交试验研究了酸化乙醇对黑桃花色苷的提取工艺，结果表明提取温度、料液比、乙醇体积分数对花色苷提取率具有显著影响，其中提取温度的影响最为显著，而提取时间对花色苷提取率的影响并不显著，得到最優工艺条件为提取温度70 ℃，料液比1∶15，乙醇体积分数50%，提取时间4 h。
参考文献：
[1] 单建伟，刘晓津，索海翠，等.植物花色苷的研究进展[J].南方农业学报，2019，50（2）：278-285.
[2] Valentina P， Ronald K， Quattrocchio F M. New challenges for the design of high value plant products： stabilization of anthocyanins in plant vacuoles[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 153.
[3] Tanaka Y， Sasaki N， Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments： anthocyanins， betalains and carotenoids[J]. Plant Journal， 2008， 54（4）： 733-749.
[4] Antonella S，DavideB，BelloccoE，et al. Chemistry pharmacology and health benefits of anthocyanins[J]. Phytotherapy Research， 2016， 30（8）：1265-1286.
[5] Landi M， Tattini M， Gould K S， et al. Multiple functional roles of anthocyanins in plant-environment interactions[J]. Environmental and Experimental Botany， 2015， 119： 4-17.
[6] 梁敏，包怡红.花色苷生物学功能的研究进展[J].天然产物研究与开发，2017（29）：1785-1790.
[7] 赵玉，王力荣，曹珂，等.桃果肉花色苷遗传多样性及红肉桃判定指标的探讨[J].植物遗传资源学报，2013，14（1）：167-172.
[8] 周萍，吴仲君，黄才欢，等.花色苷提取及纯化研究进展[J].精细化工，2020，37（8）：1513-1523.
[9] 许明秀，解思琦，张岩，等.关于果实中花色苷提取和稳定性的研究[J].果树资源学报，2020，1（4）：60-65.
[10] 秦公伟，韩豪，丁小维，等.蓝莓果渣中花色苷的超临界二氧化碳萃取工艺优化[J].2019，48（1）：109-112，117.
[11] Guo N， Ping-Kou， Jiang Y W， et al. Natural deep eutectic solvents couple with integrative extraction technique as an effective approach for mulberry anthocyanin extraction[J]. Food Chemistry， 2019， 296：78-85.
（责任编辑：易 婧）
关键词 黑桃;花色苷;提取工艺;单因素试验;正交试验
中图分类号：S662.1;TS202.1 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.22.028
花色苷是植物中广泛存在的一类水溶性色素，主要分布于花和果实的表皮细胞中，使植物的花和果实呈现出红色、紫色、蓝色等多种色彩[1-3]。花色苷在结构上属于类黄酮化合物，是一类次生代谢产物，其在植物生长、发育和防御中起到重要作用，尤其是在清除自由基方面[4-5]。此外，花色苷还具有抗炎、抗氧化、抗癌、治疗心血管疾病等作用[6]。花色苷作为一种安全、无毒的天然色素，在食品添加剂和保健食品方面具有广阔的应用前景。
桃属于蔷薇科李属，拥有丰富的种质资源。果肉颜色是评价桃种质资源的一个重要指标，根据感官判定，可分为白色、黄色、绿色、红色[7]。黑桃又名乌桃，果皮和果肉均乌黑发紫、黑里透红，具有很高的营养价值。研究表明，桃果肉呈现红色的主要原因就是花色苷的存在，花色苷含量与桃果肉红色深浅之间也具有相关性。本文以花色苷提取率为考察指标，利用单因素试验和正交试验研究黑桃花色苷提取工艺，为黑桃花色苷的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料、仪器
试验材料：黑桃材料取自江苏省南京市栖霞区八卦洲街道桃园。无水乙醇、盐酸均为国产分析纯。
试验仪器：HH·S21-4-S恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）、离心机（Eppendorf）、UV1600PC分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。
1.2 花色苷提取与检测
取成熟的黑桃果实，称取一定质量的黑桃材料，按照设定的料液比加入酸性乙醇（0.1% HCl）溶液，在恒温水浴锅中按照设定的提取温度提取一定时间，将所得提取液12 000 rpm下离心10 min，取上清液，在紫外分光光度计下测定530 nm处的吸光值，通过计算公式求得花色苷含量。
花色苷提取率（mg/100 g）=A530×V×n×100/（98.2×M）
（1）
式（1）中，A530为花色苷在530 nm处的吸光值，V为提取液体积（mL），n为测量时的稀释倍数，98.2为花色苷在530 nm波长处的平均消光系数，M为提取物质量（g）。
1.3 单因素试验
1.3.1 不同料液比条件下花色苷提取
设置料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，提取时间3 h，提取温度50 ℃，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.2 不同提取时间条件下花色苷提取
设置提取时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，料液比1∶15，提取温度50 ℃，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.3 不同提取温度条件下花色苷提取
设置提取温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，料液比1∶15，提取时间3 h，乙醇体积分数70%，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.3.4 不同乙醇体积分数条件下花色苷提取
设置乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%，料液比1∶15，提取时间3 h，提取温度50 ℃，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
1.4 正交试验
经过单因素试验分析，分别去除黑桃花色苷提取料液比、提取时间、提取温度、乙醇體积分数等4个因素中结果最差的一个条件，将剩余的4个水平按照L16（44）进行正交试验，提取黑桃花色苷，计算花色苷提取率。
2 结果与分析
2.1 料液比对黑桃花色苷提取率的影响
不同料液比条件下花色苷提取结果表明（见图1）：随着料液比的减小，黑桃花色苷提取率先升高后降低;料液比为1∶20时，花色苷提取率最高;料液比为1∶5时，花色苷提取率最低。
2.2 提取时间对黑桃花色苷提取率的影响
不同提取时间条件下花色苷提取结果表明（见图2）：随着提取时间的增加，黑桃花色苷提取率逐渐出现小幅度升高，但整体水平变化不大。
2.3 提取温度对黑桃花色苷提取率的影响
不同提取温度条件下花色苷提取结果表明（见图3）：随着提取温度的升高，黑桃花色苷提取率逐渐提高;提取温度为70 ℃时，花色苷提取率最高。
2.4 乙醇体积分数对黑桃花色苷提取率的影响
不同乙醇体积分数条件下花色苷提取结果表明（见图4）：随着乙醇体积分数的增加，黑桃花色苷提取率逐渐下降;当乙醇体积分数为50%时，花色苷提取率最高。
2.5 正交试验
经过单因素试验分析，分别去除黑桃花色苷提取料液比、提取时间、提取温度、乙醇体积分数4个因素中结果最差的一个条件，将剩余的4个水平按照L16（44）进行正交验设计，正交因素水平设计如表1所示。 正交试验结果表明，在黑桃花色苷提取过程中影响花色苷提取率的四个因素主次顺序为：提取温度>料液比>乙醇体积分数>提取时间（见表2）。为了进一步提高试验结果的科学性和准确性，对上述试验结果进行方差分析（见表3），结果显示FC>Fα=0.01，FA>Fα=0.05，FD>Fα=0.05，FB
桃拥有丰富的种质资源，根据果肉颜色的感官判断，可分为白色、黄色、绿色和红色。花色苷是使桃果肉呈现红色的主要因素，大量研究表明桃中花色苷种类主要为矢车菊-3-葡萄糖苷，此外，在一些红肉桃品种中还鉴定到矢车菊-3-芸香糖苷[7]。花色苷含量是判定红肉桃的一个重要指标，赵玉等测定了68份桃品种果肉花色苷含量并将其划分为5个等级，结合感官判定，将含量20 mg/100 g定为红肉桃的划分临界点[7]。本研究中在最优提取工艺条件下测得黑桃花色苷含量为93.87 mg/100 g，远高于已报道的红肉桃花色苷含量判定标准。
植物花色苷有多种提取方法，包括溶剂法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界CO2提取法、深晶低共熔溶剂法等[8-11]。其中溶剂法操作简单、成本低廉，因而在生产中应用最为广泛。溶剂法提取花色苷常用的溶剂有甲醇、乙醇、酸化水、酸化乙醇等[8]，在食品行业中，综合考虑提取率、成本、安全性等多方面因素，酸化乙醇具有安全、高效的优点，因而应用最为广泛。本文利用单因素试验和正交试验研究了酸化乙醇对黑桃花色苷的提取工艺，结果表明提取温度、料液比、乙醇体积分数对花色苷提取率具有显著影响，其中提取温度的影响最为显著，而提取时间对花色苷提取率的影响并不显著，得到最優工艺条件为提取温度70 ℃，料液比1∶15，乙醇体积分数50%，提取时间4 h。
参考文献：
[1] 单建伟，刘晓津，索海翠，等.植物花色苷的研究进展[J].南方农业学报，2019，50（2）：278-285.
[2] Valentina P， Ronald K， Quattrocchio F M. New challenges for the design of high value plant products： stabilization of anthocyanins in plant vacuoles[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 153.
[3] Tanaka Y， Sasaki N， Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments： anthocyanins， betalains and carotenoids[J]. Plant Journal， 2008， 54（4）： 733-749.
[4] Antonella S，DavideB，BelloccoE，et al. Chemistry pharmacology and health benefits of anthocyanins[J]. Phytotherapy Research， 2016， 30（8）：1265-1286.
[5] Landi M， Tattini M， Gould K S， et al. Multiple functional roles of anthocyanins in plant-environment interactions[J]. Environmental and Experimental Botany， 2015， 119： 4-17.
[6] 梁敏，包怡红.花色苷生物学功能的研究进展[J].天然产物研究与开发，2017（29）：1785-1790.
[7] 赵玉，王力荣，曹珂，等.桃果肉花色苷遗传多样性及红肉桃判定指标的探讨[J].植物遗传资源学报，2013，14（1）：167-172.
[8] 周萍，吴仲君，黄才欢，等.花色苷提取及纯化研究进展[J].精细化工，2020，37（8）：1513-1523.
[9] 许明秀，解思琦，张岩，等.关于果实中花色苷提取和稳定性的研究[J].果树资源学报，2020，1（4）：60-65.
[10] 秦公伟，韩豪，丁小维，等.蓝莓果渣中花色苷的超临界二氧化碳萃取工艺优化[J].2019，48（1）：109-112，117.
[11] Guo N， Ping-Kou， Jiang Y W， et al. Natural deep eutectic solvents couple with integrative extraction technique as an effective approach for mulberry anthocyanin extraction[J]. Food Chemistry， 2019， 296：78-85.
（责任编辑：易 婧）